【概要描(miao)述】兔晶(jing)狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)的相關產(chan)品(pin)：NCI-H239人非(fei)小(xiao)細(xi)胞(bao)豬(zhu)原(yuan)代(dai)主動(dong)脈(mai)平滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)滑(hua)膜間(jian)充(chong)質(zhi)幹細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)骨髓(sui)間(jian)充(chong)質(zhi)幹細(xi)胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)骨髓(sui)基(ji)質(zhi)幹細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)胰(yi)腺(xian)導管(guan)上皮(pi)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)腎(shen)小(xiao)球(qiu)系(xi)膜細(xi)胞(bao)豬(zhu)原(yuan)代(dai)卵(luan)巢(chao)顆粒(li)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)肝動(dong)脈(mai)內皮(pi)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)脊髓(sui)星(xing)形(xing)膠質(zhi)細(xi)胞(bao)

兔晶(jing)狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)

包被條(tiao)件(jian) 鼠尾(wei)膠原(yuan)Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長添加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻(pin)率(lv) 每2-3天換(huan)液(ye)壹次

生(sheng)長特性 貼(tie)壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態 上皮(pi)細(xi)胞(bao)樣

傳代(dai)特性 可傳2-3代(dai)

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶(mei)

培養(yang)條(tiao)件(jian) 氣(qi)相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔晶(jing)狀體(ti)上皮(pi)分離(li)自(zi)晶(jing)狀體(ti)組(zu)織(zhi)；晶(jing)狀體(ti)源自(zi)胚(pei)胎(tai)發(fa)育(yu)外(wai)胚(pei)層(ceng)，僅(jin)含(han)有上皮(pi)細(xi)胞(bao)及(ji)其(qi)產(chan)物(wu)，晶(jing)狀體(ti)囊膜作(zuo)為(wei)屏障(zhang)將(jiang)晶(jing)狀體(ti)與其(qi)它(ta)類型細(xi)胞(bao)wan全分開(kai)；因而，晶(jing)狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)培養(yang)既(ji)無神(shen)經和血(xue)管組(zu)織(zhi)的幹擾，又不(bu)受(shou)其(qi)它(ta)類型細(xi)胞(bao)如(ru)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)的汙染，保證了培養(yang)中(zhong)細(xi)胞(bao)成分的單壹性。晶(jing)狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)主要(yao)負(fu)責(ze)調(tiao)節晶狀體(ti)的生(sheng)理平衡(heng)，包括(kuo)電(dian)解質(zhi)和(he)液(ye)體(ti)的輸送。在正常的發(fa)育(yu)過(guo)程中(zhong)，晶狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)分化(hua)和(he)成熟(shu)，然(ran)後遷(qian)移到晶狀體(ti)內部，產(chan)生(sheng)晶體(ti)蛋白(bai)，自(zi)身(shen)也(ye)拉(la)長而變(bian)成晶(jing)狀體(ti)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)，並最終(zhong)失(shi)去(qu)細(xi)胞(bao)核(he)和(he)其(qi)它(ta)的細(xi)胞(bao)器(qi)。研究表(biao)明，晶(jing)狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)的分化(hua)和(he)極化(hua)受(shou)到了眼(yan)部液(ye)體(ti)中的生(sheng)長因子(zi)的調(tiao)控，包(bao)括(kuo)表(biao)皮(pi)生(sheng)長因子(zi)和(he)胰(yi)島(dao)素等。細(xi)胞(bao)貼(tie)壁後(hou)為(wei)扁平不(bu)規則(ze)多角形(xing)，呈(cheng)單層(ceng)生(sheng)長、連成膜狀。晶狀體(ti)上皮(pi)細(xi)胞(bao)是緊密(mi)貼(tie)附(fu)於(yu)晶(jing)狀體(ti)前(qian)囊(nang)內表(biao)面(mian)的單層(ceng)上皮(pi)細(xi)胞(bao)，其(qi)異常增殖(zhi)和分化(hua)與(yu)白(bai)內障(zhang)和後(hou)囊混濁的發(fa)生(sheng)密切(qie)相關，體(ti)外培養(yang)是(shi)研究其(qi)生(sheng)長規律的主要(yao)手段(duan)。
方(fang)法簡(jian)介(jie)：

公司(si)實驗室(shi)分離(li)的兔晶狀體(ti)上皮(pi)采用(yong)yi蛋白(bai)酶(mei)-膠原(yuan)酶(mei)混合(he)消化(hua)法結(jie)合(he)差速貼(tie)壁法，並通過(guo)上皮(pi)細(xi)胞(bao)專用(yong)培養(yang)基(ji)培養(yang)篩(shai)選制(zhi)備而(er)來(lai)，細(xi)胞(bao)總量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測(ce)：

公司(si)實驗室(shi)分離(li)的兔晶狀體(ti)上皮(pi)經BFSP2（晶狀體(ti)蛋白(bai)）免(mian)疫(yi)熒光鑒(jian)定(ding)，純度(du)可達(da)90%以(yi)上，且(qie)不含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母和(he)真菌(jun)等(deng)。

壹、細(xi)胞(bao)培養(yang)

1取(qu)材 在無菌(jun)環境下(xia)從(cong)機體(ti)取(qu)出(chu)某(mou)種組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)（視實驗目的而定），經過(guo)壹定的處理(li)（如(ru)消(xiao)化分散(san)細(xi)胞(bao)、分離(li)等(deng)）後接(jie)入(ru)培養(yang)器(qi)血(xue)中，這壹過(guo)程稱(cheng)為(wei)取(qu)材。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株的擴大培養(yang)則(ze)無取(qu)材這(zhe)壹過(guo)程。機體(ti)取(qu)出(chu)的組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)的培養(yang)稱(cheng)為(wei)原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取(qu)得(de)的組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)接(jie)入(ru)培養(yang)瓶或(huo)培養(yang)板(ban)中的過(guo)程稱(cheng)為(wei)培養(yang)。3凍存及(ji)復(fu)蘇（可參(can)閱後(hou)面(mian)有關章節）為(wei)了保(bao)存細(xi)胞(bao)，特別(bie)是不易(yi)獲得(de)的突變(bian)型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存。凍存的溫(wen)度壹般用(yong)液(ye)氮的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集(ji)至(zhi)凍存管(guan)中(zhong)加(jia)入含(han)保(bao)護(hu)劑(ji)（壹般為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘油）的培養(yang)基(ji)，以壹定的冷卻速度(du)凍存，最終(zhong)保(bao)存於(yu)液(ye)氮中。在極低(di)的溫(wen)度下(xia)，細(xi)胞(bao)保存的時間幾(ji)乎是(shi)無限(xian)的。復(fu)蘇壹般采(cai)用(yong)快(kuai)融(rong)方(fang)法，即(ji)從(cong)液(ye)氮中取(qu)出(chu)凍存管(guan)後(hou)，立(li)即放入(ru)37℃水(shui)中，使(shi)之(zhi)在壹分鐘(zhong)內迅速融(rong)解。然(ran)後將(jiang)細(xi)胞(bao)轉入(ru)培養(yang)器(qi)皿(min)中(zhong)進行培養(yang)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)分離(li)

凡是(shi)來(lai)源於(yu)胚(pei)胎(tai)、組(zu)織(zhi)器(qi)官及(ji)外周(zhou)血(xue)，經特殊(shu)分離(li)方(fang)法制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)的原(yuan)初培養(yang)的細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸浮(fu)細(xi)胞(bao)的分離(li)方(fang)法組(zu)織(zhi)材(cai)料若來(lai)自(zi)血(xue)液(ye)、羊(yang)水、胸(xiong)水或(huo)腹水(shui)的懸液(ye)材(cai)料，的方(fang)法是(shi)采(cai)用(yong)1000r/min的低(di)速離(li)心10分鐘(zhong)。經離心(xin)後(hou)由(you)於(yu)各(ge)種細(xi)胞(bao)的比(bi)重(zhong)不(bu)同(tong)可在分層(ceng)液(ye)中(zhong)形(xing)成不(bu)同(tong)層(ceng)，這(zhe)樣可根據需(xu)要(yao)收(shou)獲目的細(xi)胞(bao)。2實體(ti)組(zu)織(zhi)材(cai)料的分離(li)方(fang)法對(dui)於(yu)實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材(cai)料，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間結合(he)緊密(mi)，為(wei)了使(shi)組(zu)織(zhi)中(zhong)的細(xi)胞(bao)充分分散(san)，形(xing)成細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可(ke)采用(yong)機械(xie)分散(san)法（物(wu)理(li)裂(lie)解）和消化(hua)分離(li)法。

三、細(xi)胞(bao)增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)

目前(qian)主要(yao)有兩種用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)能力(li)的方(fang)法。壹種是(shi)直(zhi)接(jie)的方(fang)法，通(tong)過(guo)直(zhi)接(jie)測(ce)定(ding)進行分裂(lie)

的細(xi)胞(bao)數來(lai)評價細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)能力(li)。另(ling)壹種是(shi)間接(jie)的方(fang)法，即(ji)細(xi)胞(bao)活力(li)（cell viability）檢(jian)測(ce)方(fang)法，通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中健(jian)康(kang)細(xi)胞(bao)的數目來(lai)評價細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)能力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞(bao)活力(li)檢(jian)測(ce)法並不能最終(zhong)證明檢(jian)測(ce)樣品(pin)中的細(xi)胞(bao)是否在增殖(zhi)。如(ru)細(xi)胞(bao)在某(mou)壹培養(yang)條(tiao)件(jian)下會(hui)自(zi)發(fa)啟(qi)動(dong)雕亡(wang)程序(xu)，但藥(yao)物(wu)的幹擾可抑制雕(diao)亡(wang)的發(fa)生(sheng)；這時若采(cai)用(yong)細(xi)胞(bao)活力(li)檢(jian)測(ce)法，顯(xian)然(ran)可(ke)以區分兩種條(tiao)件(jian)下的細(xi)胞(bao)數量(liang)，但(dan)我(wo)們並不能從(cong)藥(yao)物(wu)幹擾組(zu)細(xi)胞(bao)數大於對照組(zu)的事實說明(ming)藥(yao)物(wu)可促(cu)進細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的結論。所以(yi)最直(zhi)接(jie)的證據應(ying)該(gai)采用(yong)方(fang)法壹。

取(qu)材：首(shou)先(xian)，用(yong)培養(yang)液(ye)濕(shi)潤所取(qu)的組(zu)織(zhi)材(cai)料，並用(yong)鋒利的眼(yan)科剪(jian)去(qu)除(chu)附(fu)在其(qi)上的脂(zhi)肪(fang)和結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)。接(jie)著(zhe)用(yong)平衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗，再用(yong)眼(yan)科彎(wan)剪(jian)將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成小(xiao)塊(kuai)。多次用(yong)PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗，直(zhi)到液(ye)體(ti)清(qing)亮、無油滴(di)為(wei)止。

接(jie)種：用(yong)濕(shi)潤的吸(xi)管吸(xi)取(qu)切(qie)碎的組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕輕吹到(dao)培養(yang)瓶皿(min)中(zhong)，並按壹定間(jian)距(ju)均(jun)勻放在培養(yang)瓶底壁上。註意不(bu)要(yao)過(guo)多，確保(bao)組(zu)織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在培養(yang)瓶底壁上。

培養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶翻(fan)轉，使(shi)瓶底朝(chao)上，在種植(zhi)了組(zu)織(zhi)塊(kuai)壹側的對側面(mian)加足(zu)培養(yang)液(ye)，避(bi)免組(zu)織(zhi)塊(kuai)與培養(yang)液(ye)接(jie)觸，然後塞(sai)緊瓶塞(sai)。將(jiang)種植(zhi)了組(zu)織(zhi)塊(kuai)的壹側朝(chao)上，靜(jing)置於(yu)37℃培養(yang)箱(xiang)中。待(dai)組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁1到(dao)3小(xiao)時後翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁的組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在培養(yang)液(ye)中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜(jing)置(zhi)。換(huan)液(ye)：每隔2到3天更(geng)換壹次培養(yang)液(ye)，或(huo)者根據培養(yang)瓶種顏(yan)色(se)的變(bian)化確(que)定(ding)換液(ye)時間。

壹、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血(xue)球計數(shu)板(ban)及(ji)蓋片(pian)用(yong)擦試幹凈(jing)，並將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋在計數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)吸(xi)出(chu)少許，滴加(jia)在蓋片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液(ye)充(chong)滿(man)蓋片(pian)和計數(shu)板(ban)之(zhi)間(jian)。

靜置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡下(xia)觀察(cha)，計算(suan)計數(shu)板(ban)四(si)大格細(xi)胞(bao)總數，壓線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左(zuo)側和(he)上方(fang)的。然後按下(xia)式(shi)計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大格細(xi)胞(bao)總數/ 4×10000

註意：鏡(jing)下(xia)偶(ou)見(jian)由(you)兩個以上細(xi)胞(bao)組(zu)成的細(xi)胞(bao)團，應按(an)單個細(xi)胞(bao)計算(suan)，若細(xi)胞(bao)團占10%以(yi)上，說明(ming)分散(san)不(bu)好，需(xu)重(zhong)新(xin)制備細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)活力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)以(yi)0.5ml加入試管(guan)中(zhong)。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭染液(ye)，染(ran)色(se)2壹3分鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少許懸液(ye)塗於(yu)載(zai)玻片(pian)上，加(jia)上蓋(gai)片(pian)。

鏡下(xia)取(qu)幾(ji)個任意視(shi)野分別(bie)計死(si)細(xi)胞(bao)和活細(xi)胞(bao)數，計細(xi)胞(bao)活力(li)。

死細(xi)胞(bao)能被臺(tai)盼(pan)蘭染上色(se)，鏡下可(ke)見(jian)深蘭色(se)的細(xi)胞(bao)，活細(xi)胞(bao)不被染(ran)色(se)，鏡下呈(cheng)無色(se)透(tou)明(ming)狀。

活力(li)測(ce)定(ding)可以和細(xi)胞(bao)計數(shu)合(he)起(qi)來(lai)進行，但要考(kao)慮(lv)到(dao)染(ran)液(ye)對(dui)原(yuan)細(xi)胞(bao)懸液(ye)的加倍稀(xi)釋作(zuo)用(yong)。