【概要描述(shu)】豬(zhu)脂(zhi)肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)的相(xiang)關(guan)產(chan)品(pin)：KMB-17 (STR)人(ren)二(er)倍(bei)胞(bao)兔原代(dai)胃(wei)cajal間(jian)質(zhi)細胞(bao)大(da)鼠原代(dai)子宮成(cheng)纖維細胞(bao)小(xiao)鼠原代(dai)淋(lin)巴管成(cheng)纖維細胞(bao)豬(zhu)原代(dai)胎(tai)盤(pan)絨(rong)毛膜滋養層細胞(bao)小(xiao)鼠原代(dai)骨(gu)髓(sui)肥大(da)細胞(bao)兔原代(dai)脾(pi)源(yuan)性(xing)內(nei)皮(pi)祖細胞(bao)小(xiao)鼠原代(dai)甲(jia)狀(zhuang)腺上(shang)皮(pi)細胞(bao)人(ren)原代(dai)臍(qi)動(dong)脈平滑肌(ji)細胞(bao)大(da)鼠原代(dai)胸(xiong)主(zhu)動(dong)脈平滑肌(ji)細胞(bao)

豬(zhu)脂(zhi)肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)

培(pei)養基 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻率 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼壁(bi)

細胞(bao)形(xing)態(tai) 成(cheng)纖維細胞(bao)樣

傳代(dai)特性(xing) 可(ke)傳5代(dai)左右(you)；3代(dai)以內(nei)狀(zhuang)態(tai)

消(xiao)化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培(pei)養條件(jian) 氣相(xiang)：空氣，95%；CO2，5%

豬(zhu)脂(zhi)肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)分(fen)離自脂肪(fang)組(zu)織(zhi)；脂(zhi)肪(fang)組(zu)織(zhi)主(zhu)要由(you)大(da)量(liang)群(qun)集(ji)的脂(zhi)肪(fang)細胞(bao)構成(cheng)，聚(ju)集(ji)成(cheng)團(tuan)的脂(zhi)肪(fang)細胞(bao)由(you)薄層疏松(song)結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)分(fen)隔成(cheng)小(xiao)葉(ye)；貯(zhu)存(cun)的脂(zhi)肪(fang)，在(zai)需要時(shi)可(ke)迅速分(fen)解(jie)成(cheng)甘(gan)油和脂肪(fang)酸(suan)，經(jing)血(xue)液(ye)輸送(song)到各組(zu)織以供利用(yong)。它(ta)們影(ying)響胰島(dao)素(su)敏感性(xing)、血壓(ya)水平、內(nei)皮(pi)功能(neng)、纖溶(rong)活(huo)動(dong)及炎癥反(fan)應(ying)，參與多種(zhong)重(zhong)要病理生(sheng)理(li)過(guo)程；脂(zhi)肪(fang)組(zu)織(zhi)已(yi)由(you)過去(qu)單(dan)純作(zuo)為能(neng)量(liang)儲(chu)存的器(qi)官而(er)成(cheng)為壹(yi)個極其重(zhong)要的內(nei)分(fen)泌系統。脂(zhi)肪(fang)組(zu)織(zhi)中(zhong)也(ye)存(cun)在(zai)壹(yi)些幹(gan)細胞(bao)群(qun)，具有自我(wo)更(geng)新能(neng)力(li)和多向(xiang)分化潛(qian)能(neng)，被(bei)稱(cheng)為脂肪(fang)組(zu)織(zhi)來(lai)源(yuan)的間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)，簡稱(cheng)脂肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)。與骨(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)相比(bi)，在(zai)來源(yuan)、細胞(bao)群(qun)特點以及(ji)分化潛(qian)能(neng)等多方面(mian)極為(wei)相(xiang)似(si)。但是(shi)，脂(zhi)肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)更易(yi)獲得(de)足(zu)夠數量(liang)的細胞(bao)，且獲(huo)取過程(cheng)中(zhong)對(dui)機(ji)體損傷更(geng)小(xiao)，是(shi)更(geng)為理(li)想的自體幹(gan)細胞(bao)源。脂(zhi)肪(fang)組(zu)織(zhi)分(fen)離得(de)到脂肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)細胞(bao)以梭(suo)形(xing)為主(zhu)要形(xing)態(tai)，BrdU可(ke)標記(ji)其細胞(bao)核。
方法(fa)簡介：

公(gong)司(si)實(shi)驗室分離的豬(zhu)脂(zhi)肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)采(cai)用膠原酶消(xiao)化(hua)法(fa)制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)，細胞(bao)總(zong)量(liang)約為5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢測：

公(gong)司(si)實(shi)驗室分離的豬(zhu)脂(zhi)肪(fang)間(jian)充(chong)質(zhi)幹(gan)經(jing)CD90免疫(yi)熒(ying)光鑒定，純度可(ke)達90%以上(shang)，且不含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌(jun)、酵(jiao)母和真菌(jun)等。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養

1取材(cai) 在(zai)無菌(jun)環(huan)境下從機(ji)體取出(chu)某種(zhong)組(zu)織細胞(bao)（視實(shi)驗目的而(er)定），經過(guo)壹(yi)定的處(chu)理（如消(xiao)化分散(san)細胞(bao)、分離等）後(hou)接入培(pei)養器血(xue)中(zhong)，這壹(yi)過程稱(cheng)為取材(cai)。如是(shi)細胞(bao)株的擴大(da)培(pei)養則無(wu)取材(cai)這(zhe)壹(yi)過程。機(ji)體取出(chu)的組(zu)織細胞(bao)的培(pei)養稱(cheng)為原代(dai)培(pei)養。2培(pei)養 將取得(de)的組(zu)織細胞(bao)接入培(pei)養瓶(ping)或培(pei)養板(ban)中(zhong)的過(guo)程稱(cheng)為培(pei)養。3凍(dong)存(cun)及(ji)復蘇(su)（可(ke)參閱後(hou)面(mian)有(you)關(guan)章節）為(wei)了保(bao)存(cun)細胞(bao)，特別是(shi)不易(yi)獲得(de)的突(tu)變型細胞(bao)或細胞(bao)株，要將細胞(bao)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的溫(wen)度壹(yi)般(ban)用液(ye)氮的溫(wen)度－196℃，將細胞(bao)收(shou)集(ji)至凍(dong)存(cun)管中(zhong)加入含(han)保護(hu)劑(ji)（壹(yi)般(ban)為二(er)甲(jia)亞(ya)碸或甘(gan)油）的培(pei)養基，以壹(yi)定的冷卻(que)速度凍(dong)存(cun)，最終保(bao)存(cun)於(yu)液(ye)氮中(zhong)。在(zai)極低的溫(wen)度下，細胞(bao)保存(cun)的時(shi)間幾(ji)乎(hu)是(shi)無(wu)限(xian)的。復蘇(su)壹(yi)般(ban)采(cai)用快(kuai)融方法(fa)，即從液(ye)氮中(zhong)取出(chu)凍(dong)存(cun)管後(hou)，立即(ji)放(fang)入37℃水(shui)中(zhong)，使之(zhi)在(zai)壹(yi)分鐘內(nei)迅(xun)速融(rong)解(jie)。然後(hou)將(jiang)細胞(bao)轉入培(pei)養器皿(min)中(zhong)進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源於(yu)胚胎(tai)、組(zu)織(zhi)器官及(ji)外周血(xue)，經(jing)特殊(shu)分(fen)離方法(fa)制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)的原初培(pei)養的細胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為(wei)原代(dai)細胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)的分(fen)離方法(fa)組織材(cai)料(liao)若來(lai)自血液(ye)、羊水、胸(xiong)水(shui)或腹(fu)水(shui)的懸(xuan)液(ye)材(cai)料(liao)，的方法(fa)是(shi)采(cai)用1000r/min的低速離心10分(fen)鐘(zhong)。經離心後(hou)由(you)於(yu)各種(zhong)細胞(bao)的比(bi)重(zhong)不同(tong)可(ke)在(zai)分層液(ye)中(zhong)形(xing)成(cheng)不同(tong)層，這樣(yang)可(ke)根(gen)據需要收(shou)獲(huo)目(mu)的細胞(bao)。2實(shi)體組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)的分(fen)離方法(fa)對(dui)於(yu)實(shi)體組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)，由(you)於(yu)細胞(bao)間結(jie)合緊(jin)密(mi)，為了使(shi)組(zu)織中(zhong)的細胞(bao)充(chong)分分散(san)，形(xing)成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可(ke)采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散(san)法(fa)（物理(li)裂解(jie)）和消化(hua)分離法。

三、細胞(bao)增殖(zhi)檢測技術

目(mu)前(qian)主(zhu)要有兩種(zhong)用(yong)於(yu)檢測細胞(bao)增殖(zhi)能(neng)力(li)的方法(fa)。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接的方法(fa)，通(tong)過直接測定進(jin)行分裂

的細胞(bao)數來(lai)評價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。另壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接的方法(fa)，即細胞(bao)活力(li)（cell viability）檢測方法(fa)，通(tong)過檢測樣品(pin)中(zhong)健康細胞(bao)的數(shu)目來(lai)評價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然，細胞(bao)活力(li)檢測法並不能(neng)最終證(zheng)明(ming)檢測樣品(pin)中(zhong)的細胞(bao)是(shi)否(fou)在(zai)增殖(zhi)。如細胞(bao)在(zai)某壹(yi)培(pei)養條件(jian)下(xia)會(hui)自發(fa)啟動(dong)雕(diao)亡程序，但藥(yao)物的幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡的發(fa)生(sheng)；這(zhe)時(shi)若采(cai)用細胞(bao)活力(li)檢測法，顯(xian)然可(ke)以區(qu)分兩(liang)種(zhong)條(tiao)件下的細胞(bao)數量(liang)，但我(wo)們並不能(neng)從藥(yao)物幹(gan)擾(rao)組細胞(bao)數大(da)於(yu)對(dui)照組的事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥(yao)物可(ke)促(cu)進(jin)細胞(bao)增殖(zhi)的結(jie)論。所以最直接的證(zheng)據應(ying)該(gai)采(cai)用方法(fa)壹(yi)。

取材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培(pei)養液(ye)濕潤所取的組(zu)織材(cai)料(liao)，並用(yong)鋒(feng)利的眼(yan)科剪去除附(fu)在(zai)其上的脂(zhi)肪(fang)和結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)。接著用(yong)平衡液(ye)（如PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再用(yong)眼(yan)科彎剪將組(zu)織塊(kuai)剪成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多次(ci)用PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到液(ye)體清(qing)亮(liang)、無(wu)油滴(di)為止(zhi)。

接種(zhong)：用(yong)濕潤的吸(xi)管吸(xi)取切碎的組(zu)織塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到培(pei)養瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並按(an)壹(yi)定間距(ju)均勻(yun)放(fang)在(zai)培(pei)養瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。註(zhu)意不要過多，確(que)保組織(zhi)塊切(qie)面(mian)貼在(zai)培(pei)養瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。

培(pei)養：將培(pei)養瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)，使瓶(ping)底(di)朝(chao)上(shang)，在(zai)種(zhong)植了組(zu)織(zhi)塊壹(yi)側的對(dui)側面(mian)加(jia)足培(pei)養液(ye)，避免組(zu)織(zhi)塊與培(pei)養液(ye)接觸，然後(hou)塞緊瓶(ping)塞。將種(zhong)植了組(zu)織(zhi)塊的壹(yi)側朝(chao)上(shang)，靜置於(yu)37℃培(pei)養箱中(zhong)。待(dai)組織(zhi)塊(kuai)貼壁(bi)1到3小(xiao)時(shi)後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的組(zu)織塊(kuai)浸沒(mei)在(zai)培(pei)養液(ye)中(zhong)，繼續(xu)靜置。換(huan)液(ye)：每(mei)隔2到3天更(geng)換(huan)壹(yi)次(ci)培(pei)養液(ye)，或者根(gen)據培(pei)養瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的變(bian)化確(que)定換(huan)液(ye)時(shi)間。

壹(yi)、原代(dai)細胞(bao)計(ji)數

將(jiang)血(xue)球(qiu)計(ji)數板(ban)及(ji)蓋片(pian)用(yong)擦試幹(gan)凈(jing)，並將(jiang)蓋片(pian)蓋在(zai)計(ji)數板(ban)上(shang)。

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出(chu)少許，滴(di)加在(zai)蓋片(pian)邊(bian)緣(yuan)，使(shi)懸(xuan)液(ye)充(chong)滿蓋片(pian)和計(ji)數板(ban)之(zhi)間(jian)。

靜置3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀察，計(ji)算(suan)計(ji)數板(ban)四(si)大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數(shu)，壓(ya)線(xian)細胞(bao)只計(ji)左側(ce)和上方的。然後(hou)按(an)下(xia)式計(ji)算(suan)：

細胞(bao)數/ml＝4大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下(xia)偶(ou)見(jian)由(you)兩個以上(shang)細胞(bao)組成(cheng)的細胞(bao)團(tuan)，應(ying)按單(dan)個細胞(bao)計(ji)算(suan)，若細胞(bao)團(tuan)占10%以上(shang)，說(shuo)明(ming)分(fen)散(san)不好，需重(zhong)新制(zhi)備(bei)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)活力(li)

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)以0.5ml加(jia)入試管中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭染(ran)液(ye)，染色(se)2壹(yi)3分鐘。

吸(xi)取少許懸(xuan)液(ye)塗(tu)於(yu)載玻片上(shang)，加上蓋片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取幾(ji)個任意視野(ye)分別計(ji)死細胞(bao)和活細胞(bao)數，計(ji)細胞(bao)活力(li)。

死(si)細胞(bao)能(neng)被(bei)臺(tai)盼蘭染(ran)上(shang)色(se)，鏡下可(ke)見(jian)深蘭(lan)色(se)的細胞(bao)，活細胞(bao)不被染(ran)色(se)，鏡下呈無色(se)透明狀(zhuang)。

活(huo)力(li)測定可(ke)以和細胞(bao)計(ji)數合起(qi)來進(jin)行，但要考慮(lv)到染液(ye)對(dui)原細胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加(jia)倍稀(xi)釋作(zuo)用。