【概要描述】羊抗大(da)鼠IgG-FITC抗體,抗體種(zhong)類,多種(zhong)試劑現貨(huo)供(gong)應(ying)!

羊抗大(da)鼠IgG-FITC抗體*,羊抗大(da)鼠IgG-FITC抗體用(yong)於免(mian)疫組化實驗(yan)，WB實驗(yan)，相(xiang)應(ying)的(de)標(biao)記抗體有HRP標(biao)記抗體，FITC標記，BIO等。

【貯存條(tiao)件(jian)】： 貯(zhu)存(cun)於-20℃. 本品應(ying)在(zai)低(di)溫(wen)下保存，長時間(jian)在(zai)暴露(lu)在空(kong)氣中，含(han)量會(hui)有所(suo)降低。

規格(ge)：0.5ml/ml

材(cai)料(liao)和(he)方法(fa)

　　. 材(cai)料(liao) 人(ren)成(cheng)骨(gu)肉瘤(liu)MG63細胞為(wei)本(ben)實驗(yan)室(shi)保存(cun)。重組質粒MycSSHL(WT)、MycSSHL(S937A S978A/2SA)以(yi)及(ji)recombinant cofilinHis6由(you)王(wang)巖(yan)教(jiao)授惠(hui)贈。脂質體 2000( Invitrogen公(gong)司)。高糖DMEM培養基(美(mei)國(guo)Gibco 公(gong)司(si))，胎(tai)牛血(xue)清(Hyclone公司(si))，和(he)EDTA(Sigma 公司(si))。A2387，KN93，CaM，重組Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain，Calbiochem)。抗體：Myc (9E0;Roche)，HA (3F0;Roche)，Pcofilin，Cofilin(Santa Cruz)， CaMKⅡδδ4 (Trans Genic Inc.)，PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免(mian)疫共沈澱(dian)(Protein Gagarose)試(shi)劑盒(邁(mai)晨科技(ji)有限(xian)公(gong)司(si))。

　　.2 蛋白(bai)印跡(ji)實驗(yan) MG63細胞鋪(pu)於35 mmol/L培養皿(min)中，待(dai)細胞密(mi)度達(da)到60%～70%時，轉(zhuan)染(ran)MycSSHL，48 h後換(huan)無血清培養基培養3 h，分(fen)別(bie)加入濃度為(wei)0.5，，2.5，5 μmol/L的(de)A2387孵(fu)育0 min後(hou)裂解(jie)細胞，離心取(qu)上(shang)清加入凝膠加樣緩沖液,沸水(shui)浴(yu)上(shang)加熱5 min，上樣、電泳、轉(zhuan)膜(mo)、雜交(jiao)〔壹抗分(fen)別(bie)為(wei)Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及(ji)CaMK Ⅱ δ(4)〕、ECL顯色(se)。

　　.3 體外激(ji)酶(mei)測(ce)定 MycSSHL(WT)及(ji)其(qi)突變(bian)體(ti)MycSSHL(2 SA)分(fen)別(bie)轉(zhuan)染(ran)至(zhi)MG63細胞，48 h後采用(yong)免(mian)疫共沈澱(dian)(Protein Gagarose)試(shi)劑盒的(de)方法及(ji)抗cmyc抗體，對照組為(wei)抗IgG抗體。回收MycSSHL，加入0.6 μg/ml重組活性CaMKⅡ(單獨(du)或同(tong)時(shi)加入抑制劑KN93)以(yi)及(ji)00 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 於 20 μl 激(ji)酶(mei)反應(ying)緩沖液中，30℃反應(ying)40 min。反應(ying)產物(wu)進行(xing)SDSPAGE電泳、轉(zhuan)膜(mo)，應(ying)用(yong)放(fang)射自(zi)顯影(ying)技(ji)術(shu)檢(jian)測(ce)32P 標記的SSHL水(shui)平(ping)。

　　.4 體外SSHL磷酸酶(mei)活性測(ce)定實驗(yan) MycSSHL(WT)或MycSSHL (2 SA)轉(zhuan)染(ran)至(zhi)MG63細胞，48 h後，采用(yong)免(mian)疫共沈澱(dian)(Protein Gagarose)試(shi)劑盒的(de)方法及(ji)抗cmyc抗體，對照組為(wei)抗IgG抗體。回收MycSSHL，加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨(du)或同(tong)時(shi)加入抑制劑KN93)，20 μg/ml CaM，以(yi)及(ji) 6.3 μg/ml cofilinHis6 於 20 μl 反應(ying)緩沖液(50 mol/L HEPES，pH 7.4，0. mol/L CaCl2，0.5 mol/L EDTA，3 mol/L MgCl2，00 mmol/L NaCl， mol/L dithiothreitol，0.5 mg/ml BSA， μg/ml leupeptin),中30℃反應(ying)2 h。反應(ying)產物(wu)進行(xing)SDSPAGE電泳、轉(zhuan)膜(mo)、雜交(jiao)(壹抗分(fen)別(bie)為(wei)Pcofilin，Cofilin， cmyc 抗體)、ECL顯色(se)。

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