【概要描述(shu)】堿(jian)性(xing)磷(lin)酸酶(mei)活性(xing)檢(jian)測(ce)試劑盒(he) Western免(mian)疫印(yin)跡(ji)(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋(dan)白(bai)質轉(zhuan)移(yi)到膜上，然(ran)後(hou)利(li)用抗體(ti)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

堿(jian)性(xing)磷(lin)酸酶(mei)活性(xing)檢(jian)測(ce)試劑盒(he)Western Blot技(ji)術(shu):

壹、 原(yuan)理

與Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法類(lei)似(si)，但(dan)Western Blot采用的(de)是(shi)聚丙(bing)烯酰胺凝膠電(dian)泳(yong)，被(bei)檢(jian)測(ce)物是(shi)蛋(dan)白(bai)質，“探針”是(shi)抗體(ti)，“顯(xian)色”用標記的(de)二抗。經(jing)過(guo)PAGE分(fen)離的(de)蛋(dan)白(bai)質樣品，轉移(yi)到固相(xiang)載體（例如硝(xiao)#纖(xian)維素薄膜）上，固(gu)相(xiang)載(zai)體以非(fei)共價鍵形式吸附(fu)蛋(dan)白(bai)質，且(qie)能保(bao)持電(dian)泳(yong)分(fen)離的(de)多(duo)肽類(lei)型(xing)及(ji)其生(sheng)物學(xue)活性(xing)不(bu)變(bian)。以固相載(zai)體上的(de)蛋(dan)白(bai)質或(huo)多(duo)肽作為(wei)抗(kang)原(yuan)，與對應(ying)的(de)抗體(ti)起免疫反(fan)應(ying)，再(zai)與(yu)酶(mei)或(huo)同(tong)位(wei)素標(biao)記的(de)第(di)二抗體(ti)起反應，經(jing)過(guo)底物顯(xian)色或(huo)放射自顯(xian)影(ying)以檢(jian)測(ce)電(dian)泳(yong)分(fen)離的(de)特異性(xing)目的(de)基因(yin)表達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成分。該(gai)技術(shu)也廣(guang)泛應用於(yu)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白(bai)水(shui)平(ping)的(de)表達(da)。

二、分類(lei)堿(jian)性(xing)磷(lin)酸酶(mei)活性(xing)檢(jian)測(ce)試劑盒(he)現(xian)常(chang)用的(de)有(you)底物化(hua)學(xue)發光(guang)ECL和底物DAB呈(cheng)色，體(ti)同水(shui)平和實驗(yan)條(tiao)件的(de)是(shi)用*種(zhong)方(fang)法，目前(qian)發(fa)表文(wen)章(zhang)通(tong)常(chang)是(shi)用底物化(hua)學(xue)發光(guang)ECL。只要買現(xian)成的(de)試劑盒(he)就(jiu)行(xing)，操作(zuo)也(ye)比較(jiao)簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如下(xia)（二抗用HRP標記）：反(fan)應底物為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米諾(nuo)，如遇(yu)到HRP，即發光(guang)，可使膠片(pian)曝(pu)光(guang)，就(jiu)可洗(xi)出條(tiao)帶(dai)。

三、 主要(yao)試劑

、 丙(bing)烯酰胺和N，N’-亞甲雙(shuang)丙(bing)烯酰胺，應以溫(wen)熱(re)（以(yi)利(li)於(yu)溶解雙丙(bing)稀(xi)酰胺）的(de)去離(li)子(zi)水(shui)配制含有(you)29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)丙(bing)烯酰胺儲存(cun)液(ye)丙(bing)稀(xi)酰胺29g，N，N-亞甲叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保(bao)存(cun)。嚴(yan)格(ge)核(he)實(shi)PH不得(de)超過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發生脫(tuo)氨基反(fan)應是(shi)光(guang)催化(hua)或堿催化的(de)。使用期(qi)不得(de)超過(guo)兩(liang)個(ge)月，隔(ge)幾個(ge)月須(xu)重(zhong)新(xin)配制。如有(you)沈澱(dian)，可(ke)以(yi)過(guo)濾(lv)。 2、 十二烷(wan)基硫#鈉(na)SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水(shui)配制，室溫(wen)保(bao)存(cun)。

3、 分離膠緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水稀(xi)釋到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃縮膠緩(huan)沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水稀(xi)釋到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖液(ye)必(bi)須(xu)使用Tris堿制(zhi)備，再(zai)用HCL調節(jie)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二胺催化過(guo)硫#銨(an)形(xing)成自由基而(er)加(jia)速兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺的(de)聚合(he)。PH太(tai)低時，聚合(he)反(fan)應(ying)受(shou)到抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫#胺溶液(ye)。提(ti)供兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺聚合所必(bi)須(xu)的(de)自由基。去(qu)離子水配制數ml，臨(lin)用前配制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備用。按:或:2比(bi)例與蛋(dan)白(bai)質樣品混(hun)合，在(zai)沸(fei)水終(zhong)煮3min混(hun)勻(yun)後(hou)再上樣，壹般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用蒸餾(liu)水溶解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極(ji)緩(huan)沖液(ye)。臨用前稀(xi)釋0倍(bei)。

8、 轉移(yi)緩(huan)沖液(ye)：配制L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)，需稱取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入(ru)200ml甲醇，加(jia)水至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春紅(hong)染(ran)液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗(li)春紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊# 30g 加(jia)水至(zhi)00ml 用時上述(shu)儲(chu)存(cun)液(ye)稀(xi)釋0倍(bei)即成麗(li)春紅(hong)S使用液。使用後(hou)應予(yu)以廢棄。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒，戴手(shou)套(tao)操作(zuo)），溶於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)標(biao)記的(de)第(di)二抗體(ti)。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲基甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲基甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA