【概要(yao)描述(shu)】Bradford蛋白質(zhi)定(ding)量試劑(ji)盒(he) Western免(mian)疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是將(jiang)蛋白質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用抗體進行(xing)檢測(ce)。

Bradford蛋白質(zhi)定(ding)量試劑(ji)盒(he)  Western Blot技術:

壹、 原理

與Southern或Northern雜(za)交(jiao)方法類似(si)，但(dan)Western Blot采用的是聚丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝(ning)膠(jiao)電泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物(wu)是(shi)蛋白質(zhi)，“探針(zhen)”是抗體，“顯色(se)”用標記的(de)二抗。經過PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白質(zhi)樣(yang)品，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固(gu)相載(zai)體（例如硝(xiao)#纖(xian)維素(su)薄膜）上，固(gu)相載(zai)體以(yi)非(fei)共(gong)價鍵(jian)形(xing)式(shi)吸(xi)附(fu)蛋白質(zhi)，且(qie)能保(bao)持電泳分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽(tai)類型(xing)及其(qi)生(sheng)物(wu)學活(huo)性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相載(zai)體上的(de)蛋白質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)作為(wei)抗原(yuan)，與對應(ying)的抗體起免(mian)疫(yi)反應(ying)，再與酶或同位素(su)標記的(de)第二(er)抗體起反(fan)應(ying)，經過底(di)物(wu)顯(xian)色(se)或(huo)放射(she)自(zi)顯影(ying)以(yi)檢(jian)測(ce)電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)特異性(xing)目的(de)基因(yin)表(biao)達(da)的(de)蛋白成(cheng)分(fen)。該技術也廣(guang)泛應(ying)用於檢測蛋白水平(ping)的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類(lei)Bradford蛋白質(zhi)定(ding)量試劑(ji)盒(he) 現常用的有底(di)物(wu)化(hua)學發光ECL和底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體同水平(ping)和實(shi)驗條件的(de)是(shi)用*種方法，目前(qian)發表文章通常是用底(di)物(wu)化(hua)學發光ECL。只要(yao)買(mai)現成(cheng)的試(shi)劑(ji)盒(he)就行(xing)，操作(zuo)也比(bi)較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應(ying)底(di)物(wu)為(wei)過氧化(hua)物(wu)+魯米諾，如遇到(dao)HRP，即發光，可使膠片曝(pu)光，就可洗出(chu)條帶。

三、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙(bing)烯酰(xian)胺(an)和N，N’-亞甲雙(shuang)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)，應(ying)以(yi)溫(wen)熱(re)（以(yi)利(li)於溶(rong)解(jie)雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)）的去離子水配(pei)制含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺(an)和%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)儲(chu)存液丙(bing)稀酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞甲叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)g，加H2O至 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避光保(bao)存。嚴(yan)格核(he)實(shi)PH不得(de)超過7.0，因(yin)可以(yi)發生脫氨(an)基(ji)反應(ying)是光催化(hua)或堿催化(hua)的。使用期(qi)不(bu)得超過兩個月，隔(ge)幾個月須重(zhong)新(xin)配(pei)制。如有沈(chen)澱(dian)，可以(yi)過濾(lv)。 2、 十(shi)二(er)烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配(pei)制，室(shi)溫(wen)保(bao)存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水稀釋(shi)到(dao)00ml終體積(ji)。過濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加水稀釋(shi)到(dao)00ml終體積(ji)。過濾(lv)後(hou)40C保(bao)存。這(zhe)兩(liang)種緩沖(chong)液必(bi)須使用Tris堿制備，再用HCL調(tiao)節(jie)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液N，N，N’N’四甲基(ji)乙二(er)胺(an)催化(hua)過硫#銨形(xing)成(cheng)自(zi)由基(ji)而加速(su)兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺(an)的(de)聚(ju)合。PH太低時，聚合(he)反(fan)應(ying)受到抑制。0%（w/v）過硫#胺溶(rong)液。提供(gong)兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺(an)聚(ju)合(he)所必(bi)須的(de)自(zi)由基(ji)。去離子水配(pei)制數ml，臨用前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按:或:2比例與蛋白質(zhi)樣(yang)品混(hun)合，在(zai)沸水終煮(zhu)3min混(hun)勻後(hou)再(zai)上(shang)樣(yang)，壹般為(wei)20-25ul，總蛋白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電泳緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用蒸餾水溶解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電極緩沖(chong)液。臨用前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液，需稱取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入(ru)200ml甲醇(chun)，加水至總(zong)量L。

9、 麗春紅染(ran)液儲(chu)存液：麗春紅S 2g 三#乙#30g 磺(huang)基(ji)水楊# 30g 加水至00ml 用時上述(shu)儲(chu)存液稀釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗春紅S使用液。使用後(hou)應(ying)予(yu)以(yi)廢棄。

0、 脫脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉（有毒，戴手套操作(zuo)），溶於(yu)磷(lin)#緩沖(chong)鹽溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過氧化(hua)物(wu)酶標記的(de)第二(er)抗體。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。  做線(xian)粒體膜UCP2蛋白的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫(xie)成Western Blot），提取(qu)線粒體後(hou)凍存（未(wei)加(jia)蛋白酶抑制劑(ji)），樣(yang)品不(bu)能反復凍融;，加(jia)蛋白酶抑制劑(ji)。同(tong)時，建(jian)議檢查(zha)Western Blot過程， 提高壹抗濃(nong)度(du)。對於(yu)加(jia)蛋白酶抑制劑(ji)來說(shuo)，壹般加(jia)PMSF就(jiu)可以(yi)了，能多(duo)加幾中種蛋白酶抑制劑(ji)。
同(tong)壹蛋白樣(yang)品能(neng)同時進行(xing)兩種因(yin)子(zi)的(de)Western Blot檢(jian)測(ce)，有的甚至(zhi)可以(yi)同(tong)時(shi)測(ce)幾十(shi)種樣(yang)品。
如果(guo)是膜蛋白和胞漿(jiang)蛋白，所用的去垢劑(ji)就(jiu)要(yao)溫(wen)和得(de)多(duo)，這時(shi)加上(shang)NaF去抑制磷#化(hua)酶的活(huo)性(xing)。
樣(yang)品的(de)蛋白含(han)量很低，每微升(sheng)不(bu)到微(wei)克，但(dan)是在(zai)轉(zhuan)膜時(shi)經常會發現只有(you)壹部分(fen)蛋白轉(zhuan)到(dao)了膜上(shang)，就(jiu)是在(zai)轉(zhuan)膜後(hou)染(ran)膠發現有的(de)孔所有的(de)蛋白條帶都(dou)在，只是(shi)顏色(se)變(bian)淡了，可以(yi)加(jia)大(da)上(shang)樣(yang)量，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可以(yi)用減少電(dian)流(liu)延長(chang)時(shi)間，多(duo)加5-0%甲醇(chun)。
想分(fen)離(li)的(de)蛋白是(shi)分(fen)子(zi)量(liang)260kd的，SDS-PAGE電泳的分(fen)離(li)膠(jiao)濃(nong)度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋白不(bu)好(hao)做
如果(guo)上樣(yang)量超載(zai)，可以(yi)濃(nong)縮樣(yang)品，也可以(yi)根(gen)據妳(ni)的目(mu)標分(fen)子(zi)量(liang)透析(xi)掉(diao)壹部分(fen)小(xiao)分(fen)子(zi)蛋白。壹般地(di)，超載(zai)30%是(shi)不會有問題的(de)。如果(guo)已(yi)經超了不少了，而且(qie)小分(fen)子(zi)量(liang)的也要(yao)，可以(yi)考(kao)慮加(jia)大(da)膠(jiao)的厚度(du)，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹兩年(nian)沒有問題，zui關(guan)鍵(jian)兩條：不要(yao)被(bei)蛋白酶水解掉(diao);不要(yao)被(bei)細(xi)菌(jun)消(xiao)化(hua)掉（也是(shi)被(bei)酶水解了）。
采用DAB顯色(se)技(ji)術，二(er)抗是(shi)化(hua)的多(duo)克隆(long)抗體，三抗是(shi)親(qin)和素(su)體系(xi)，不(bu)能(neng)使用脫脂奶(nai)粉，脫脂奶(nai)粉會影響(xiang)親(qin)和素(su)的生(sheng)成(cheng)，因(yin)為(wei)脫脂奶(nai)粉中含(han)，用BSA代替應(ying)該好壹點.
Western Blot壹般上(shang)樣(yang)30-00微克(ke)不等，結果(guo)跟目的(de)蛋白的(de)豐(feng)度(du)、上樣(yang)量、壹二抗的(de)量(liang)和撫(fu)育時(shi)間都(dou)有關(guan)系(xi)，也與顯色(se)時(shi)間長(chang)短(duan)有關(guan)。開(kai)始摸條件時(shi)，為(wei)了拿到(dao)陽性(xing)結果(guo)，各個步驟(zhou)都(dou)可以(yi)量(liang)多(duo)壹點時(shi)間長(chang)壹點，當(dang)然(ran)背(bei)景也就(jiu)出來了。要(yao)拿到(dao)好的(de)結果(guo)，如果(guo)抗體好的(de)話(hua)比(bi)較容易，抗體不好(hao)的(de)話(hua)就(jiu)需要(yao)反(fan)復(fu)地(di)試(shi)了，當(dang)然(ran)有(you)的不適(shi)合Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做也不(bu)行(xing)。所以(yi)拿到(dao)好的(de)結果(guo)不容(rong)易(yi)。