【概要(yao)描(miao)述(shu)】兔脊髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)細胞(bao)的(de)相(xiang)關(guan)產(chan)品(pin)：Tcam-2人睪丸(wan)精(jing)原細(xi)胞(bao)瘤(liu)細胞(bao)小(xiao)鼠原代卵(luan)巢內膜(mo)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原代腎小管上皮(pi)細胞(bao)人原代(dai)冠(guan)狀(zhuang)動(dong)脈(mai)內皮(pi)細胞(bao)人原代(dai)甲(jia)狀(zhuang)腺(xian)微(wei)血(xue)管內皮(pi)細胞(bao)人原代(dai)牙(ya)齦間(jian)充質幹(gan)細胞(bao)人原代(dai)胰腺成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)大(da)鼠原代脊(ji)髓(sui)星(xing)形(xing)膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)人原代(dai)肺(fei)動(dong)脈(mai)外(wai)膜(mo)成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原代肺(fei)血(xue)管平(ping)滑(hua)肌細胞(bao)

兔脊髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)細胞(bao)

包被條(tiao)件 PLL（0.1mg/ml）

培養基 含(han)B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻(pin)率(lv) 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特(te)性 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 神(shen)經(jing)元(yuan)細胞(bao)樣

傳代(dai)特(te)性 屬(shu)於終(zhong)末(mo)分(fen)化細(xi)胞(bao)；屬(shu)於不(bu)增(zeng)殖細胞(bao)群(qun)

消(xiao)化(hua)液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶

培養條件 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔脊髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)分離(li)自(zi)脊髓(sui)組織(zhi)；脊(ji)髓(sui)是(shi)細(xi)細的管束(shu)狀(zhuang)的(de)神(shen)經(jing)結(jie)構(gou)，位(wei)於脊(ji)柱(zhu)的椎(zhui)管內且被脊(ji)椎(zhui)保護；是(shi)源自(zi)腦的(de)中樞(shu)神(shen)經(jing)系(xi)統(tong)延伸部(bu)分(fen)。中樞(shu)神(shen)經(jing)系(xi)統(tong)的(de)細胞(bao)依(yi)靠復(fu)雜的(de)聯(lian)系來(lai)處理傳遞(di)信息。脊髓(sui)的(de)主(zhu)要(yao)功能(neng)是傳送(song)腦(nao)與外(wai)周之(zhi)間(jian)的神(shen)經(jing)信息。人和(he)脊(ji)椎動(dong)物(wu)中樞(shu)神(shen)經(jing)系(xi)統(tong)的(de)壹(yi)部(bu)分(fen)，在(zai)椎管(guan)裏面(mian)，上端連接延髓(sui)，兩(liang)旁(pang)發出成對(dui)的(de)神(shen)經(jing)，分(fen)布(bu)到(dao)四(si)肢、體壁(bi)和(he)內臟。脊髓(sui)的(de)內部有(you)壹(yi)個(ge)H形(xing)(蝴(hu)蝶型)灰質區(qu)，主(zhu)要(yao)由神(shen)經(jing)細(xi)胞(bao)構(gou)成；在(zai)灰質區(qu)周圍(wei)為白質區(qu)，主(zhu)要(yao)由有(you)髓(sui)神(shen)經(jing)纖維組成(cheng)；脊(ji)髓(sui)是(shi)許多(duo)簡(jian)單(dan)反(fan)射(she)的(de)中樞(shu)。脊(ji)髓(sui)兩(liang)旁(pang)發出許多(duo)成(cheng)對(dui)的(de)神(shen)經(jing)(稱(cheng)為脊神(shen)經(jing))分(fen)布(bu)到(dao)全(quan)身(shen)皮(pi)膚、肌肉和(he)內臟器官(guan)。脊(ji)髓(sui)是(shi)周圍(wei)神(shen)經(jing)與(yu)腦(nao)之(zhi)間(jian)的通路(lu)，也是許多(duo)簡(jian)單(dan)反(fan)射(she)活(huo)動(dong)的(de)低級(ji)中樞(shu)。按脊(ji)神(shen)經(jing)的(de)出(chu)入(ru)可(ke)把脊髓(sui)也分為相(xiang)應(ying)的(de)31節，31對脊神(shen)經(jing)就(jiu)是(shi)由不(bu)同(tong)的脊椎發(fa)出(chu)的(de)。神(shen)經(jing)系(xi)統(tong)最基本的(de)結(jie)構和(he)功能(neng)單(dan)位(wei)是(shi)神(shen)經(jing)元(yuan)，即(ji)神(shen)經(jing)細(xi)胞(bao)，其大(da)小(xiao)和(he)外(wai)觀(guan)在(zai)中樞(shu)神(shen)經(jing)系(xi)統(tong)中差異很(hen)大(da)。但都具有胞(bao)體和(he)樹突、軸(zhou)突。胞(bao)體又叫(jiao)核(he)周體，內含神(shen)經(jing)絲(si)、微管(guan)、內質網(wang)、遊(you)離(li)核(he)糖體和(he)壹(yi)個(ge)有(you)明(ming)顯(xian)核(he)仁的(de)核(he)。壹(yi)些(xie)大(da)神(shen)經(jing)元(yuan)突起(qi)的粗面(mian)內質網(wang)可(ke)用Nissl染色顯(xian)示，在(zai)光鏡(jing)下(xia)是灰藍色(se)斑(ban)塊(kuai)狀(zhuang)，稱(cheng)為尼(ni)氏小(xiao)體。樹突和(he)軸(zhou)突是(shi)神(shen)經(jing)元(yuan)的突(tu)起(qi)，能在(zai)神(shen)經(jing)元(yuan)之(zhi)間(jian)傳遞(di)電(dian)沖動(dong)，突(tu)起(qi)的大(da)小(xiao)和(he)形(xing)態(tai)各(ge)不(bu)相(xiang)同(tong)，很難(nan)用常(chang)規(gui)的顯(xian)微(wei)鏡鑒別。脊髓(sui)組織(zhi)內含有(you)大(da)量膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)，神(shen)經(jing)元(yuan)含量少，分(fen)離(li)純(chun)化(hua)難(nan)度(du)大(da)，且脊(ji)髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)細胞(bao)是(shi)高度(du)分化(hua)的(de)終(zhong)末(mo)細(xi)胞(bao)，不(bu)能(neng)分裂增(zeng)殖，培養要(yao)求(qiu)高。剛接種(zhong)的(de)脊(ji)髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)呈(cheng)圓形(xing)，體積(ji)小(xiao)，透(tou)亮，無(wu)突起(qi)。培養2-3d，可(ke)見胞(bao)體增(zeng)大(da)，突(tu)起(qi)增(zeng)多延長；培養6-7d，細胞(bao)體大(da)飽(bao)滿，突(tu)起(qi)明(ming)顯(xian)增(zeng)加(jia)延長並交(jiao)織成(cheng)網(wang)，光(guang)暈(yun)明(ming)顯(xian)，立(li)體感強(qiang)。培養20d後(hou)，死亡(wang)細胞(bao)明(ming)顯(xian)增(zeng)加(jia)，細(xi)胞(bao)出(chu)現(xian)內空(kong)泡，突起(qi)粗細不(bu)均(jun)，甚(shen)至脫壁，發生(sheng)細(xi)胞(bao)崩(beng)解(jie)。
方(fang)法(fa)簡介(jie)：

公司(si)實(shi)驗(yan)室分(fen)離(li)的兔脊髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)采用膠(jiao)原(yuan)酶(mei)&聯(lian)合消化(hua)法(fa)、神(shen)經(jing)元(yuan)專(zhuan)用培養基培養篩選(xuan)結合(he)化(hua)學試劑抑(yi)制法(fa)制備而(er)來(lai)，細(xi)胞(bao)總(zong)量約(yue)為5×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢測：

公司(si)實(shi)驗(yan)室分(fen)離(li)的兔脊髓(sui)神(shen)經(jing)元(yuan)經β-Tubulin免(mian)疫(yi)熒(ying)光鑒定，純(chun)度(du)可(ke)達90%以上，且不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細(xi)菌、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培養

1取(qu)材 在(zai)無(wu)菌環(huan)境(jing)下(xia)從(cong)機(ji)體取(qu)出(chu)某(mou)種(zhong)組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目的而(er)定(ding)），經(jing)過壹(yi)定(ding)的(de)處理（如消化(hua)分(fen)散細胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接入(ru)培養器血(xue)中，這壹(yi)過(guo)程(cheng)稱(cheng)為取材。如(ru)是(shi)細胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大(da)培養則無(wu)取材這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)。機(ji)體取(qu)出(chu)的組織(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)培養稱為原代培養。2培養 將(jiang)取得的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)接入(ru)培養瓶或(huo)培養板中的過(guo)程(cheng)稱(cheng)為培養。3凍存(cun)及復(fu)蘇(su)（可(ke)參(can)閱(yue)後(hou)面(mian)有關(guan)章節）為了保存(cun)細胞(bao)，特(te)別是不(bu)易(yi)獲(huo)得的(de)突(tu)變型細(xi)胞(bao)或(huo)細胞(bao)株(zhu)，要(yao)將(jiang)細胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的溫度(du)壹(yi)般(ban)用液氮(dan)的溫度(du)－196℃，將(jiang)細胞(bao)收(shou)集(ji)至(zhi)凍存(cun)管中加(jia)入(ru)含保護劑（壹(yi)般(ban)為二甲(jia)亞碸(feng)或(huo)甘油(you)）的培養基，以壹(yi)定(ding)的(de)冷卻速(su)度(du)凍存(cun)，最終(zhong)保(bao)存(cun)於液(ye)氮(dan)中。在(zai)極(ji)低(di)的(de)溫度(du)下(xia)，細胞(bao)保(bao)存(cun)的時間(jian)幾(ji)乎(hu)是無(wu)限的。復(fu)蘇(su)壹(yi)般(ban)采用快(kuai)融(rong)方法(fa)，即(ji)從(cong)液(ye)氮(dan)中取出(chu)凍存(cun)管後(hou)，立即(ji)放入(ru)37℃水中，使(shi)之(zhi)在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內迅速(su)融(rong)解(jie)。然(ran)後(hou)將(jiang)細胞(bao)轉(zhuan)入培養器皿(min)中進(jin)行(xing)培養。

二、原(yuan)代細胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源於胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器(qi)官(guan)及(ji)外(wai)周血(xue)，經(jing)特(te)殊分(fen)離(li)方法(fa)制備而(er)來(lai)的(de)原(yuan)初培養的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為原代細(xi)胞(bao)。1懸浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分離(li)方法(fa)組織(zhi)材料(liao)若來(lai)自(zi)血液(ye)、羊(yang)水、胸水或腹(fu)水的懸液(ye)材料(liao)，的(de)方法(fa)是采用1000r/min的低(di)速(su)離(li)心(xin)10分(fen)鐘。經離(li)心(xin)後(hou)由於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比(bi)重不(bu)同(tong)可(ke)在(zai)分層液(ye)中形(xing)成(cheng)不(bu)同(tong)層，這(zhe)樣可(ke)根(gen)據需(xu)要(yao)收(shou)獲(huo)目的細胞(bao)。2實(shi)體組織(zhi)材料(liao)的(de)分離(li)方法(fa)對於實(shi)體組織(zhi)材料(liao)，由於細(xi)胞(bao)間(jian)結合緊(jin)密(mi)，為了使(shi)組織(zhi)中的細(xi)胞(bao)充(chong)分分散，形(xing)成(cheng)細胞(bao)懸液(ye)，可(ke)采用機(ji)械分(fen)散法(fa)（物理裂(lie)解(jie)）和(he)消(xiao)化分離(li)法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖檢測技術

目前主要(yao)有(you)兩種(zhong)用於檢(jian)測細(xi)胞(bao)增(zeng)殖能力(li)的(de)方(fang)法(fa)。壹(yi)種(zhong)是(shi)直(zhi)接的(de)方(fang)法(fa)，通過直(zhi)接測定(ding)進(jin)行(xing)分(fen)裂(lie)

的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能力(li)。另壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接的(de)方(fang)法(fa)，即(ji)細胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測方(fang)法(fa)，通過檢(jian)測樣品中健康(kang)細胞(bao)的(de)數(shu)目來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能力(li)。顯(xian)然(ran)，細胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)並不(bu)能(neng)最終(zhong)證(zheng)明(ming)檢測樣品中的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在(zai)增(zeng)殖。如細(xi)胞(bao)在(zai)某(mou)壹(yi)培養條件下(xia)會自(zi)發啟(qi)動(dong)雕(diao)亡(wang)程(cheng)序(xu)，但藥(yao)物(wu)的幹(gan)擾可(ke)抑(yi)制雕(diao)亡(wang)的發(fa)生(sheng)；這(zhe)時若采用細胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)，顯(xian)然(ran)可(ke)以區分兩(liang)種(zhong)條(tiao)件下(xia)的細胞(bao)數(shu)量，但我們(men)並不(bu)能(neng)從(cong)藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於對(dui)照(zhao)組的(de)事(shi)實(shi)說明(ming)藥(yao)物(wu)可(ke)促進(jin)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖的結(jie)論。所以最直(zhi)接的(de)證(zheng)據應(ying)該(gai)采用方法(fa)壹(yi)。

取(qu)材：首(shou)先(xian)，用培養液濕潤所取的組織(zhi)材料(liao)，並用鋒利的(de)眼科(ke)剪(jian)去(qu)除(chu)附在(zai)其上(shang)的(de)脂肪(fang)和(he)結(jie)締組織(zhi)。接著(zhe)用平(ping)衡(heng)液（如PBS或Hanks液）漂洗，再用眼科(ke)彎剪(jian)將(jiang)組織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小塊(kuai)。多(duo)次(ci)用PBS或Hanks液(ye)漂洗，直到液(ye)體清亮、無(wu)油滴為止。

接種(zhong)：用濕潤的吸(xi)管(guan)吸取切(qie)碎的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到(dao)培養瓶皿(min)中，並按壹(yi)定(ding)間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放在(zai)培養瓶底(di)壁上。註意不(bu)要(yao)過(guo)多，確保(bao)組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼在(zai)培養瓶底(di)壁上。

培養：將(jiang)培養瓶翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底(di)朝上，在(zai)種(zhong)植(zhi)了組織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側(ce)的(de)對(dui)側(ce)面(mian)加(jia)足培養液，避免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培養液接觸(chu)，然(ran)後(hou)塞緊(jin)瓶塞。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹(yi)側(ce)朝上，靜(jing)置於37℃培養箱中。待組織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到3小(xiao)時後(hou)翻瓶，使(shi)貼壁(bi)的(de)組織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在(zai)培養液中，繼續(xu)靜(jing)置。換液：每(mei)隔2到3天更(geng)換(huan)壹(yi)次(ci)培養液，或(huo)者根(gen)據培養瓶種(zhong)顏(yan)色(se)的(de)變化(hua)確定(ding)換液時間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)

將(jiang)血球(qiu)計數(shu)板及蓋(gai)片(pian)用擦試幹(gan)凈，並將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數(shu)板上。

將(jiang)細胞(bao)懸液(ye)吸(xi)出(chu)少許，滴(di)加(jia)在(zai)蓋(gai)片(pian)邊緣，使(shi)懸液(ye)充(chong)滿(man)蓋(gai)片(pian)和(he)計(ji)數(shu)板之(zhi)間(jian)。

靜(jing)置3分鐘。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)，計(ji)算計數(shu)板四(si)大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數(shu)，壓(ya)線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左(zuo)側(ce)和(he)上(shang)方的。然(ran)後(hou)按下(xia)式計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註意：鏡下(xia)偶(ou)見(jian)由兩(liang)個以上細(xi)胞(bao)組成(cheng)的(de)細胞(bao)團，應(ying)按單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算，若細胞(bao)團占10%以上(shang)，說(shuo)明(ming)分散不(bu)好，需(xu)重新(xin)制備(bei)細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二、原(yuan)代細胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細胞(bao)懸液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少許懸液(ye)塗(tu)於載(zai)玻(bo)片上(shang)，加(jia)上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取幾(ji)個任意視(shi)野分(fen)別計死細胞(bao)和(he)活(huo)細胞(bao)數(shu)，計細胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被臺盼蘭染上色(se)，鏡下(xia)可(ke)見深(shen)蘭色的細胞(bao)，活(huo)細胞(bao)不(bu)被染色，鏡(jing)下(xia)呈(cheng)無(wu)色透(tou)明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力(li)測定(ding)可(ke)以和(he)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)合起(qi)來(lai)進(jin)行(xing)，但要(yao)考(kao)慮到染液對(dui)原細(xi)胞(bao)懸液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀釋(shi)作用。