【概要(yao)描(miao)述】鼠抗人卵巢(chao)癌抗原(yuan)單(dan)克隆(long)抗體 CA25 Antigen Western免疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是(shi)將蛋白(bai)質(zhi)轉移到膜上，然(ran)後(hou)利用(yong)抗體進行(xing)檢(jian)測(ce)。

鼠(shu)抗人卵巢(chao)癌抗原(yuan)單(dan)克隆(long)抗體 CA25 Antigen Western Blot技術: 做線(xian)粒(li)體膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫(xie)成Western Blot），提(ti)取線(xian)粒(li)體後(hou)凍存（未(wei)加(jia)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)），樣(yang)品不能反復凍融;，加(jia)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)。同時(shi)，建(jian)議(yi)檢(jian)查(zha)Western Blot過程(cheng)， 提(ti)高壹(yi)抗濃(nong)度。對於加(jia)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)來說(shuo)，壹(yi)般加(jia)PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了，能多加(jia)幾中(zhong)種(zhong)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)。
同壹(yi)蛋白(bai)樣(yang)品能同時(shi)進(jin)行(xing)兩(liang)種(zhong)因子的(de)Western Blot檢(jian)測(ce)，有的甚(shen)至(zhi)可(ke)以(yi)同時(shi)測(ce)幾十種(zhong)樣(yang)鼠(shu)抗人卵巢(chao)癌抗原(yuan)單(dan)克隆(long)抗體 CA25 Antigen 如(ru)果(guo)是(shi)膜蛋白(bai)和(he)胞漿蛋白(bai)，所(suo)用(yong)的去(qu)垢劑(ji)就(jiu)要溫和得(de)多，這時加(jia)上NaF去(qu)抑(yi)制(zhi)磷(lin)#化酶的活性。
樣(yang)品的蛋(dan)白(bai)含量(liang)很(hen)低，每(mei)微升(sheng)不(bu)到微克(ke)，但(dan)是(shi)在轉膜時經常(chang)會發現(xian)只(zhi)有壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白(bai)轉到了膜上，就(jiu)是(shi)在轉膜後(hou)染膠(jiao)發(fa)現(xian)有的(de)孔所有(you)的蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶都在，只(zhi)是(shi)顏(yan)色變(bian)淡(dan)了，可(ke)以(yi)加(jia)大上(shang)樣(yang)量(liang)，轉移時可(ke)以(yi)用(yong)減少(shao)電流延(yan)長(chang)時間(jian)，多(duo)加(jia)5-0%甲醇(chun)。
想分(fen)離(li)的蛋(dan)白(bai)是(shi)分(fen)子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳的(de)分(fen)離(li)膠(jiao)濃(nong)度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋(dan)白(bai)不(bu)好做
如(ru)果(guo)上(shang)樣(yang)量(liang)超(chao)載(zai)，可(ke)以(yi)濃(nong)縮(suo)樣(yang)品，也可(ke)以(yi)根(gen)據妳的(de)目標(biao)分(fen)子量(liang)透(tou)析掉壹(yi)部分(fen)小分(fen)子蛋(dan)白(bai)。壹(yi)般地，超載(zai)30%是(shi)不會有問(wen)題的。如(ru)果(guo)已(yi)經超(chao)了不少(shao)了，而且(qie)小分(fen)子量(liang)的(de)也要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮(lv)加(jia)大膠(jiao)的(de)厚(hou)度，可(ke)以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白(bai)變(bian)性後(hou)存放(fang)-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒有(you)問題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不(bu)要(yao)被蛋(dan)白(bai)酶水解(jie)掉;不(bu)要被細菌消化掉(diao)（也是(shi)被酶水解(jie)了）。
采(cai)用(yong)DAB顯(xian)色技(ji)術，二抗是(shi)化的(de)多克隆抗體，三抗是(shi)親和(he)素(su)體系(xi)，不(bu)能使用(yong)脫脂(zhi)奶粉(fen)，脫脂奶粉(fen)會影響(xiang)親(qin)和素(su)的(de)生成(cheng)，因為(wei)脫脂(zhi)奶粉中(zhong)含，用(yong)BSA代替應(ying)該(gai)好壹(yi)點 CA25 Antigen Western Blot壹(yi)般上樣(yang)30-00微克(ke)不(bu)等，結(jie)果(guo)跟目的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐度、上樣(yang)量(liang)、壹(yi)二抗的(de)量(liang)和(he)撫育(yu)時間(jian)都有關(guan)系(xi)，也(ye)與(yu)顯(xian)色時(shi)間(jian)長(chang)短有關(guan)。開始摸條(tiao)件(jian)時(shi)，為(wei)了拿到陽(yang)性結(jie)果(guo)，各個(ge)步驟都可(ke)以(yi)量(liang)多(duo)壹(yi)點時間(jian)長(chang)壹(yi)點，當然(ran)背景(jing)也就(jiu)出來了。要拿到好的結果，如(ru)果(guo)抗體好的話(hua)比較容易(yi)，抗體不好的話(hua)就(jiu)需要反復地試(shi)了，當然(ran)有(you)的不適合(he)Western Blot的怎(zen)樣(yang)做也(ye)不(bu)行(xing)。所以(yi)拿到好的結果不容易(yi)。

CA25 Antigen  壹(yi)、 原理

與(yu)Southern或Northern雜(za)交(jiao)方法(fa)類似，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的是(shi)聚(ju)丙烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電泳，被檢(jian)測(ce)物是(shi)蛋白(bai)質(zhi)，“探針(zhen)”是(shi)抗體，“顯(xian)色”用(yong)標記(ji)的(de)二抗。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品，轉移到固(gu)相載(zai)體（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜）上，固(gu)相載(zai)體以(yi)非共(gong)價鍵(jian)形式吸(xi)附蛋白(bai)質(zhi)，且(qie)能保持(chi)電泳分(fen)離(li)的多(duo)肽類型(xing)及(ji)其生(sheng)物學(xue)活性不(bu)變(bian)。以(yi)固(gu)相載(zai)體上的(de)蛋白(bai)質(zhi)或多肽作為(wei)抗原(yuan)，與(yu)對應(ying)的(de)抗體起(qi)免疫(yi)反應，再與(yu)酶或同位(wei)素(su)標記(ji)的(de)第(di)二抗體起(qi)反應，經過(guo)底物顯(xian)色或(huo)放(fang)射自(zi)顯(xian)影以(yi)檢(jian)測(ce)電泳分(fen)離(li)的特(te)異(yi)性目的(de)基因表達的蛋(dan)白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技術也(ye)廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於檢(jian)測(ce)蛋白(bai)水(shui)平的表達。

二、分(fen)類  現(xian)常(chang)用(yong)的有(you)底物化學(xue)發光ECL和底(di)物DAB呈色(se)，體同水(shui)平(ping)和實驗條(tiao)件(jian)的(de)是(shi)用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目前(qian)發(fa)表文章(zhang)通常(chang)是(shi)用(yong)底物化學(xue)發光ECL。只(zhi)要買現(xian)成的(de)試(shi)劑(ji)盒就(jiu)行(xing)，操作也比較簡(jian)單(dan)，原理如(ru)下(xia)（二抗用(yong)HRP標記(ji)）：反應底物為(wei)過氧(yang)化物+魯米諾，如(ru)遇到HRP，即發(fa)光(guang)，可(ke)使膠(jiao)片(pian)曝光(guang)，就(jiu)可(ke)洗出條(tiao)帶。

三、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙烯(xi)酰胺(an)和N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯(xi)酰胺(an)，應以(yi)溫(wen)熱(re)（以(yi)利(li)於溶解雙丙稀(xi)酰(xian)胺(an)）的去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制含有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯(xi)酰胺(an)儲存(cun)液(ye)丙稀(xi)酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞甲叉(cha)雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺(an)g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保存(cun)。嚴格(ge)核實PH不得(de)超過7.0，因可(ke)以(yi)發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨(an)基反應是(shi)光催(cui)化或(huo)堿催(cui)化的(de)。使用(yong)期(qi)不得(de)超過兩(liang)個月(yue)，隔幾個月(yue)須重(zhong)新配(pei)制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱，可(ke)以(yi)過(guo)濾(lv)。  2、 十二烷基硫(liu)#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制，室(shi)溫保存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水稀(xi)釋到00ml終體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水稀(xi)釋到00ml終體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保存(cun)。這兩(liang)種(zhong)緩沖液(ye)必須使(shi)用(yong)Tris堿制備，再用(yong)HCL調節(jie)PH值，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶液(ye)N，N，N’N’四甲基乙(yi)二胺催(cui)化過(guo)硫(liu)#銨形成自由基而加(jia)速(su)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺(an)的(de)聚(ju)合。PH太低(di)時，聚(ju)合反應受(shou)到抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶液(ye)。提(ti)供兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺(an)聚(ju)合所(suo)必須的(de)自由基。去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制數(shu)ml，臨用(yong)前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備用(yong)。按:或:2比例與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣(yang)品混(hun)合，在(zai)沸(fei)水終煮3min混(hun)勻後(hou)再上樣(yang)，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電泳緩沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電極緩沖液(ye)。臨用(yong)前稀(xi)釋0倍。

8、 轉移緩沖液(ye)：配制(zhi)L轉移緩沖液(ye)，需稱(cheng)取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入(ru)200ml甲醇(chun)，加(jia)水至(zhi)總(zong)量L。

9、 麗春(chun)紅染液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗春(chun)紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基水(shui)楊# 30g 加(jia)水至(zhi)00ml 用(yong)時上(shang)述儲(chu)存液(ye)稀(xi)釋0倍即成(cheng)麗春(chun)紅S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應予以(yi)廢(fei)棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有毒(du)，戴(dai)手(shou)套操作），溶於磷(lin)#緩沖鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過氧(yang)化物酶標記(ji)的(de)第(di)二抗體。

5、 NBT（溶於70%二甲基甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二甲基甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。