【概(gai)要(yao)描述(shu)】鼠(shu)抗人(ren)乳(ru)腺(xian)癌(ai)相(xiang)關(guan)抗原(yuan)單克隆(long)抗體(ti) CA5-3 Antigen Western免疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是將蛋白(bai)質(zhi)轉移(yi)到(dao)膜上，然後利用抗體(ti)進行(xing)檢測(ce)。

鼠(shu)抗人(ren)乳(ru)腺(xian)癌(ai)相(xiang)關(guan)抗原(yuan)單克隆(long)抗體(ti) CA5-3 Antigen Western Blot技術(shu): 做(zuo)線粒(li)體膜UCP2蛋白(bai)的Western Blot （以下簡寫(xie)成Western Blot），提(ti)取(qu)線粒(li)體後凍存（未加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑），樣品(pin)不(bu)能反復(fu)凍融;，加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑。同時(shi)，建議(yi)檢查Western Blot過(guo)程(cheng)， 提(ti)高(gao)壹(yi)抗濃(nong)度。對(dui)於加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑來說(shuo)，壹(yi)般加PMSF就(jiu)可(ke)以了，能多加幾中(zhong)種(zhong)蛋白(bai)酶抑(yi)制劑。
同壹(yi)蛋白(bai)樣品(pin)能同時(shi)進行(xing)兩(liang)種因(yin)子的Western Blot檢測(ce)，有的(de)甚(shen)至(zhi)可(ke)以同時(shi)測(ce)幾十(shi)種樣(yang)鼠(shu)抗人(ren)乳(ru)腺(xian)癌(ai)相(xiang)關(guan)抗原(yuan)單克隆(long)抗體(ti) CA5-3 Antigen 如(ru)果是膜蛋白(bai)和胞漿(jiang)蛋白(bai)，所(suo)用的去(qu)垢(gou)劑(ji)就(jiu)要(yao)溫(wen)和得多，這(zhe)時(shi)加上NaF去抑(yi)制磷#化(hua)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)。
樣品(pin)的(de)蛋白(bai)含(han)量很(hen)低，每微(wei)升不到(dao)微克，但(dan)是在轉(zhuan)膜時(shi)經常(chang)會發現(xian)只有(you)壹(yi)部分蛋白(bai)轉到(dao)了膜上，就(jiu)是在轉(zhuan)膜後染(ran)膠發(fa)現(xian)有的(de)孔(kong)所(suo)有的(de)蛋白(bai)條帶(dai)都在(zai)，只(zhi)是顏色(se)變(bian)淡了(le)，可(ke)以加大(da)上樣量，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可(ke)以用減少(shao)電(dian)流(liu)延(yan)長(chang)時(shi)間(jian)，多(duo)加5-0%甲(jia)醇(chun)。
想(xiang)分(fen)離的蛋白(bai)是分子量260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳的(de)分離(li)膠(jiao)濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白(bai)不好做
如(ru)果上樣量超(chao)載(zai)，可(ke)以濃縮樣(yang)品(pin)，也(ye)可(ke)以根據妳(ni)的(de)目標分子量透(tou)析(xi)掉(diao)壹(yi)部分小(xiao)分子蛋白(bai)。壹(yi)般地(di)，超(chao)載(zai)30%是不會(hui)有(you)問(wen)題(ti)的。如(ru)果已(yi)經超(chao)了(le)不少(shao)了(le)，而(er)且(qie)小(xiao)分子量的(de)也(ye)要(yao)，可(ke)以考慮加大(da)膠(jiao)的(de)厚(hou)度，可(ke)以試試.5mm的(de) comb。
蛋白(bai)變(bian)性後存放-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒有(you)問(wen)題(ti)，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條：不(bu)要(yao)被蛋白(bai)酶水解掉(diao);不要(yao)被細菌(jun)消(xiao)化(hua)掉(diao)（也是被酶水解了）。
采(cai)用DAB顯色(se)技術(shu)，二(er)抗是化(hua)的(de)多(duo)克隆(long)抗體(ti)，三抗是親和素體系(xi)，不能使(shi)用脫(tuo)脂(zhi)奶粉(fen)，脫(tuo)脂(zhi)奶粉(fen)會(hui)影響親和素的生(sheng)成，因為(wei)脫(tuo)脂(zhi)奶粉(fen)中(zhong)含(han)，用BSA代(dai)替應該好壹(yi)點(dian) CA5-3 AntigenWestern Blot壹(yi)般上樣30-00微(wei)克不(bu)等，結果跟目的蛋白(bai)的豐(feng)度、上樣量、壹(yi)二(er)抗的(de)量和撫育時(shi)間(jian)都有(you)關(guan)系(xi)，也與(yu)顯色(se)時(shi)間(jian)長(chang)短(duan)有關(guan)。開始摸(mo)條(tiao)件時(shi)，為(wei)了(le)拿到(dao)陽(yang)性(xing)結果，各(ge)個步(bu)驟都可(ke)以量多(duo)壹(yi)點(dian)時(shi)間(jian)長(chang)壹(yi)點(dian)，當然背景(jing)也(ye)就(jiu)出來了(le)。要(yao)拿到(dao)好的結果，如(ru)果抗體(ti)好的話(hua)比較容易，抗體(ti)不(bu)好的話(hua)就(jiu)需要(yao)反復(fu)地(di)試了(le)，當然有的(de)不(bu)適合Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做(zuo)也不行(xing)。所(suo)以拿到(dao)好的結果不容易。 CA5-3 Antigen

  公(gong)司其他(ta)產(chan)品(pin)列(lie)表(biao)： LOP00 Androgen Receptor 免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H,M,R, Rb
LOP002 BAX 免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H,M,R,Rb   

LOP003 Bcl-2 免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H,M,R,Rb
LOP004 CD34免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H
LOP005 C-erbB-2免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H
LOP006 Cyclin D免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H
LOP007 E-cadherin 免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H,M,R,Rb
LOP008 EGFR 免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H,M,R,Rb
LOP009 ER、PR 免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H,M,R,Rb
LOP00 ER/PR/C-erbB-2免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H
LOP0 ER/PR免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H
LOP02 Factor Ⅷ Related Ag免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒 H 
 

與Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方(fang)法類似(si)，但Western Blot采(cai)用的是聚丙(bing)烯酰胺凝膠電泳，被檢測(ce)物是蛋白(bai)質(zhi)，“探(tan)針”是抗體(ti)，“顯色(se)”用標記的二抗。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白(bai)質(zhi)樣品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固相(xiang)載體(ti)（例(li)如(ru)硝#纖(xian)維(wei)素(su)薄膜）上，固相(xiang)載體(ti)以非(fei)共價(jia)鍵(jian)形(xing)式(shi)吸附(fu)蛋白(bai)質(zhi)，且能保持(chi)電(dian)泳分(fen)離的(de)多(duo)肽類型(xing)及其生(sheng)物學(xue)活(huo)性不變(bian)。以固相(xiang)載體(ti)上的蛋白(bai)質(zhi)或多(duo)肽作為抗原(yuan)，與(yu)對(dui)應的抗體(ti)起免疫(yi)反應，再(zai)與(yu)酶(mei)或(huo)同(tong)位(wei)素標記的第二(er)抗體(ti)起反應，經過(guo)底(di)物顯色(se)或放(fang)射自(zi)顯影以檢測(ce)電泳分(fen)離的(de)特異(yi)性目(mu)的(de)基因表(biao)達的蛋白(bai)成分。該(gai)技術(shu)也(ye)廣泛應(ying)用於檢測(ce)蛋白(bai)水平(ping)的表(biao)達。

二、分(fen)類  現(xian)常(chang)用的有(you)底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL和底物DAB呈(cheng)色(se)，體同(tong)水平(ping)和實(shi)驗(yan)條件(jian)的(de)是用*種方(fang)法，目(mu)前(qian)發(fa)表(biao)文章通(tong)常(chang)是用底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買現(xian)成的試劑(ji)盒就(jiu)行，操作也(ye)比較簡單，原理如(ru)下（二(er)抗用HRP標記）：反應底(di)物為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發光(guang)，可(ke)使(shi)膠片(pian)曝光(guang)，就(jiu)可(ke)洗(xi)出條(tiao)帶(dai)。

三、 主要(yao)試劑(ji)

、 丙(bing)烯酰胺和N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰胺，應以溫(wen)熱（以利於溶解(jie)雙丙(bing)稀酰胺）的(de)去(qu)離(li)子水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰胺儲存液丙(bing)稀酰胺29g，N，N-亞甲(jia)叉雙丙(bing)稀酰胺g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保存。嚴格核(he)實(shi)PH不(bu)得(de)超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可(ke)以發生(sheng)脫(tuo)氨基(ji)反應是光(guang)催化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用期不(bu)得(de)超(chao)過(guo)兩(liang)個月(yue)，隔幾個月(yue)須重(zhong)新配制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可(ke)以過(guo)濾(lv)。  2、 十(shi)二烷(wan)基硫(liu)#鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水配制，室溫(wen)保(bao)存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水稀釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用約48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後40C保(bao)存。這(zhe)兩(liang)種緩(huan)沖(chong)液必須使(shi)用Tris堿(jian)制備(bei)，再(zai)用HCL調節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成自(zi)由基(ji)而加速(su)兩(liang)種丙(bing)稀酰胺的聚合。PH太(tai)低時(shi)，聚(ju)合(he)反應受(shou)到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶液。提(ti)供兩(liang)種丙(bing)稀酰胺聚合所(suo)必須的(de)自(zi)由基(ji)。去離(li)子水配制數ml，臨(lin)用前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按:或(huo):2比例與蛋白(bai)質(zhi)樣品(pin)混(hun)合，在(zai)沸(fei)水終煮(zhu)3min混(hun)勻後再(zai)上樣，壹(yi)般為20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨#電(dian)泳緩(huan)沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾(liu)水溶解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電(dian)極緩(huan)沖(chong)液。臨(lin)用前(qian)稀釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液：配制L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲(jia)醇(chun)，加水至總量L。

9、 麗(li)春紅染(ran)液儲存液：麗(li)春紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基(ji)水楊# 30g 加水至00ml 用時(shi)上述儲(chu)存液稀釋0倍(bei)即(ji)成麗(li)春紅S使(shi)用液。使(shi)用後應予(yu)以廢棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒(du)，戴(dai)手(shou)套(tao)操作），溶於磷#緩(huan)沖(chong)鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)標記的第二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲(jia)基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲(jia)基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。