【概要描(miao)述(shu)】鼠(shu)抗人白細胞共(gong)同抗原(yuan)單(dan)克(ke)隆(long)抗體(ti) Leukocyte Common Antigen (LCA) Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白質轉移到膜上，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗體(ti)進(jin)行檢(jian)測(ce)。

鼠(shu)抗人白細胞共(gong)同抗原(yuan)單(dan)克(ke)隆(long)抗體(ti) Leukocyte Common Antigen （LCA） Western Blot技(ji)術:

壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方(fang)法(fa)類(lei)似(si)，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是(shi)聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳，被檢(jian)測(ce)物(wu)是(shi)蛋(dan)白質，“探針”是(shi)抗體(ti)，“顯色”用(yong)標(biao)記的(de)二抗。經過PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白質樣品(pin)，轉移到固相載體(ti)（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維(wei)素薄(bo)膜）上(shang)，固相載體(ti)以(yi)非(fei)共(gong)價鍵(jian)形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋白質，且能保持電(dian)泳分離(li)的(de)多肽(tai)類(lei)型及其生物(wu)學活(huo)性(xing)不變(bian)。以(yi)固相載體(ti)上(shang)的(de)蛋白質或(huo)多肽(tai)作(zuo)為抗原(yuan)，與對(dui)應的(de)抗體(ti)起免(mian)疫反(fan)應，再(zai)與酶(mei)或(huo)同位素標記(ji)的(de)第二(er)抗體(ti)起反(fan)應，經過底物(wu)顯色或(huo)放(fang)射自(zi)顯影以(yi)檢(jian)測(ce)電(dian)泳分離(li)的(de)特異(yi)性(xing)目的(de)基因(yin)表(biao)達的(de)蛋白成分。該(gai)技(ji)術也廣(guang)泛應用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白水(shui)平(ping)的(de)表達(da)。

二(er)、分類(lei)鼠(shu)抗人白細胞共(gong)同抗原(yuan)單(dan)克(ke)隆(long)抗體(ti) Leukocyte Common Antigen （LCA） 現(xian)常(chang)用(yong)的(de)有底物(wu)化(hua)學發(fa)光(guang)ECL和底物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同水(shui)平(ping)和實(shi)驗條(tiao)件的(de)是(shi)用(yong)*種方法(fa)，目前(qian)發(fa)表文(wen)章(zhang)通常是(shi)用(yong)底物(wu)化(hua)學發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現成(cheng)的(de)試劑盒(he)就行，操(cao)作(zuo)也比較(jiao)簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如(ru)下（二(er)抗用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應底物(wu)為過氧(yang)化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾(nuo)，如遇到HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可使(shi)膠(jiao)片(pian)曝(pu)光(guang)，就可洗出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主要試劑

、 丙烯酰(xian)胺和N，N’-亞(ya)甲雙丙烯酰(xian)胺，應(ying)以(yi)溫熱（以(yi)利(li)於(yu)溶(rong)解(jie)雙丙稀(xi)酰胺）的(de)去離(li)子水(shui)配制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙丙烯酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液丙稀(xi)酰胺29g，N，N-亞(ya)甲叉(cha)雙丙稀(xi)酰胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於(yu)棕色瓶，4℃避(bi)光(guang)保存(cun)。嚴(yan)格核實(shi)PH不得(de)超(chao)過7.0，因(yin)可以發(fa)生脫氨基反(fan)應是(shi)光(guang)催(cui)化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期(qi)不得(de)超(chao)過兩個(ge)月(yue)，隔(ge)幾(ji)個(ge)月(yue)須重(zhong)新配制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱，可以過濾(lv)。 Leukocyte Common Antigen （LCA） 、 十(shi)二(er)烷(wan)基硫#鈉(na)SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配制(zhi)，室溫保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾(lv)後(hou)40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩種緩沖(chong)液必(bi)須使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制備，再(zai)用(yong)HCL調(tiao)節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基乙二胺催(cui)化(hua)過硫#銨(an)形(xing)成(cheng)自(zi)由基而(er)加(jia)速(su)兩種丙稀(xi)酰胺的(de)聚(ju)合(he)。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚(ju)合(he)反(fan)應受到抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過硫#胺(an)溶(rong)液。提(ti)供(gong)兩種丙稀(xi)酰胺聚(ju)合(he)所必須的(de)自(zi)由基。去離(li)子水(shui)配制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩(huan)沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用(yong)。按(an):或(huo):2比例(li)與(yu)蛋(dan)白質樣品(pin)混合(he)，在沸(fei)水(shui)終(zhong)煮(zhu)3min混勻(yun)後(hou)再(zai)上樣，壹(yi)般(ban)為20-25ul，總(zong)蛋白量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳緩沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶(rong)解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極(ji)緩沖(chong)液。臨(lin)用(yong)前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍。

8、 轉移緩(huan)沖(chong)液：配制(zhi)L轉移緩(huan)沖(chong)液，需(xu)稱取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲(jia)醇(chun)，加(jia)水(shui)至(zhi)總(zong)量L。

9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染(ran)液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上述(shu)儲(chu)存(cun)液稀(xi)釋(shi)0倍即(ji)成麗(li)春(chun)紅(hong)S使(shi)用(yong)液。使(shi)用(yong)後(hou)應(ying)予以廢棄(qi)。

SABC（小(xiao)鼠(shu)/兔IgG）-POD濃(nong)縮型SABC試(shi)劑盒(he)
LOP633 SABC（小鼠(shu)IgG）-CY3
LOP634 SABC（小鼠(shu)IgG）-FITC
LOP635 SABC（小鼠(shu)IgG）-POD
LOP636 SABC（小鼠(shu)IgG）-POD濃縮(suo)型SABC試劑盒(he)
LOP637 SABC（小鼠(shu)IgM）-CY3
LOP638 SABC（小鼠(shu)IgM）-FITC
LOP639 SABC（小鼠(shu)IgM）-POD
LOP640 SABC-AP（大(da)鼠(shu)IgG）
LOP64 SABC-AP（人IgG）
LOP642 SABC-AP（山(shan)羊(yang)IgG）
LOP643 SABC-AP（兔(tu)IgG）
LOP644 SABC-AP（小鼠(shu)/兔IgG）
LOP645 SABC-AP（小(xiao)鼠(shu)IgG）
LOP646 SABC-AP（小鼠(shu)IgM）
LOP647 SABC—DS 980元(yuan)/kit
LOP648 Western Blotting（大(da)鼠(shu)IgG）
LOP649 Western Blotting（山(shan)羊(yang)IgG）
0、 脫脂奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒，戴(dai)手(shou)套(tao)操(cao)作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標記的(de)第二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲(jia)基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。