【概要(yao)描(miao)述】鼠抗人白細(xi)胞(bao)特異(yi)性單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Leukocyte Specific Protein Western免(mian)疫印跡(Western Blot)是將(jiang)蛋(dan)白質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然後(hou)利(li)用(yong)抗體進(jin)行檢測(ce)。

鼠抗人白細(xi)胞(bao)特異(yi)性單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Leukocyte Specific Protein  Western Blot技術(shu): 做線粒(li)體膜(mo)UCP2蛋白的(de)Western Blot （以下(xia)簡寫(xie)成(cheng)Western Blot），提取(qu)線粒(li)體後(hou)凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋白酶抑(yi)制(zhi)劑），樣品不(bu)能反(fan)復凍融;，加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑。同時(shi)，建議(yi)檢查Western Blot過(guo)程， 提高(gao)壹抗濃度(du)。對於加(jia)蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑來說(shuo)，壹般(ban)加(jia)PMSF就可(ke)以了，能多加(jia)幾中(zhong)種(zhong)蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑。
同壹蛋(dan)白(bai)樣品能同時(shi)進(jin)行兩種因子(zi)的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的(de)甚(shen)至可(ke)以(yi)同時(shi)測(ce)幾十(shi)種(zhong)樣品。
 鼠抗人白細(xi)胞(bao)特異(yi)性單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Leukocyte Specific Protein 如(ru)果是膜蛋白和胞(bao)漿蛋白，所用的(de)去垢(gou)劑就要(yao)溫和得(de)多，這(zhe)時加(jia)上NaF去抑(yi)制磷(lin)#化(hua)酶的(de)活性。
樣品的(de)蛋白含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每微升不(bu)到微(wei)克(ke)，但是在(zai)轉膜時經(jing)常會(hui)發現只(zhi)有(you)壹部(bu)分(fen)蛋白(bai)轉(zhuan)到了膜上(shang)，就是在(zai)轉膜後(hou)染(ran)膠發現有(you)的(de)孔所有(you)的(de)蛋白條帶都(dou)在(zai)，只(zhi)是顏色變淡了，可以(yi)加大(da)上(shang)樣量，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可(ke)以(yi)用減少電(dian)流(liu)延(yan)長(chang)時(shi)間(jian)，多加(jia)5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分(fen)離的(de)蛋白是分(fen)子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的(de)分(fen)離膠濃度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白不(bu)好做
如(ru)果上(shang)樣量超(chao)載(zai)，可(ke)以(yi)濃(nong)縮(suo)樣品，也可(ke)以根據(ju)妳的(de)目標(biao)分(fen)子(zi)量透(tou)析掉(diao)壹部(bu)分(fen)小(xiao)分(fen)子(zi)蛋白(bai)。壹般(ban)地(di)，超(chao)載(zai)30%是不(bu)會有(you)問題的(de)。如果已(yi)經(jing)超(chao)了不(bu)少了，而且小(xiao)分(fen)子(zi)量的(de)也要(yao)，可以考(kao)慮(lv)加大膠的(de)厚(hou)度(du)，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白變性後(hou)存(cun)放-80℃，壹兩年沒有(you)問題，zui關鍵兩條：不(bu)要被(bei)蛋白(bai)酶水(shui)解掉(diao);不(bu)要被(bei)細菌(jun)消(xiao)化(hua)掉(diao)（也是被(bei)酶水(shui)解了）。
采(cai)用DAB顯(xian)色(se)技術(shu)，二(er)抗是化(hua)的(de)多克(ke)隆(long)抗體，三(san)抗是親(qin)和素(su)體系(xi)，不(bu)能使(shi)用(yong)脫脂(zhi)奶粉(fen)，脫脂(zhi)奶粉(fen)會(hui)影響(xiang)親(qin)和素(su)的(de)生成，因為(wei)脫脂(zhi)奶粉(fen)中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代(dai)替(ti)應該好(hao)壹點(dian).   Leukocyte Specific Protein   Western Blot壹般(ban)上(shang)樣30-00微克(ke)不(bu)等，結(jie)果跟(gen)目的(de)蛋白的(de)豐度(du)、上樣量、壹二(er)抗的(de)量和撫(fu)育(yu)時間(jian)都(dou)有(you)關系(xi)，也與(yu)顯(xian)色(se)時(shi)間長短有(you)關。開(kai)始摸(mo)條(tiao)件(jian)時，為(wei)了拿到(dao)陽性結(jie)果，各個步驟(zhou)都(dou)可以量多壹點(dian)時(shi)間長(chang)壹點(dian)，當(dang)然(ran)背景(jing)也就出(chu)來了。要拿(na)到好(hao)的(de)結(jie)果，如(ru)果抗體好(hao)的(de)話比較(jiao)容(rong)易，抗體不(bu)好的(de)話就需(xu)要反復地試(shi)了，當(dang)然(ran)有(you)的(de)不(bu)適合Western Blot的(de)怎樣做也不(bu)行。所以拿(na)到好(hao)的(de)結(jie)果不(bu)容(rong)易。

壹、 原理(li)

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交方法類似，但Western Blot采(cai)用的(de)是聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝膠電(dian)泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物(wu)是蛋白質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是抗體，“顯(xian)色(se)”用(yong)標記的(de)二(er)抗。經過(guo)PAGE分(fen)離的(de)蛋白質(zhi)樣品，轉移(yi)到(dao)固相(xiang)載(zai)體（例(li)如硝#纖(xian)維素(su)薄膜）上(shang)，固相(xiang)載(zai)體以(yi)非共價(jia)鍵形式吸附蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且能保(bao)持電(dian)泳(yong)分(fen)離的(de)多肽(tai)類型及其生物(wu)學(xue)活性不(bu)變。以固相(xiang)載(zai)體上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或(huo)多肽(tai)作(zuo)為(wei)抗原，與(yu)對應的(de)抗體起(qi)免疫反(fan)應，再(zai)與(yu)酶或(huo)同(tong)位(wei)素(su)標(biao)記的(de)第二(er)抗體起(qi)反應，經過(guo)底物顯(xian)色(se)或(huo)放射(she)自(zi)顯(xian)影(ying)以(yi)檢測(ce)電(dian)泳(yong)分(fen)離的(de)特異(yi)性目的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的(de)蛋白成分(fen)。該技術(shu)也廣(guang)泛(fan)應用於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水(shui)平的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類  Leukocyte Specific Protein  現常用(yong)的(de)有(you)底物化(hua)學(xue)發光(guang)ECL和(he)底物DAB呈(cheng)色，體同(tong)水平和實(shi)驗條(tiao)件(jian)的(de)是用*種方法，目前(qian)發表(biao)文(wen)章(zhang)通常是用底物化(hua)學(xue)發光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買現成(cheng)的(de)試(shi)劑盒(he)就行，操作(zuo)也比(bi)較簡單(dan)，原理(li)如(ru)下(xia)（二(er)抗用HRP標(biao)記）：反(fan)應底物為(wei)過氧化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾(nuo)，如遇(yu)到(dao)HRP，即發光(guang)，可(ke)使(shi)膠片(pian)曝光(guang)，就可(ke)洗出(chu)條帶。

三、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑

、 丙(bing)烯酰(xian)胺(an)和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)，應以溫(wen)熱（以(yi)利於溶解雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)）的(de)去離(li)子(zi)水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)儲(chu)存液(ye)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)g，加(jia)H2O至 00ml。）儲(chu)於棕色(se)瓶，4℃避(bi)光(guang)保(bao)存(cun)。嚴(yan)格核(he)實(shi)PH不(bu)得(de)超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可以發生脫氨(an)基(ji)反(fan)應是光(guang)催化(hua)或(huo)堿催化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期(qi)不(bu)得(de)超(chao)過(guo)兩個月，隔幾個月須重(zhong)新(xin)配制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可(ke)以過濾。   Leukocyte Specific Protein 2 兔抗人突觸(chu)素多克(ke)隆(long)抗體 Synaptophysin
LOP48 鼠抗人突觸(chu)素單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Synaptophysin（SY）
LOP482 兔抗人突觸(chu)素多克(ke)隆(long)抗體 Synaptophysin（SY） #鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水配制，室(shi)溫保(bao)存。

LOP483 鼠抗人Tau蛋白(bai)單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Tau Protein
LOP484 鼠抗人omerase（Catalytic Unit）單(dan)克(ke)隆(long)抗體 omerase（Catalytic Unit）
LOP485 鼠抗人肌腱(jian)蛋白(bai)單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Tenascin（TN）
LOP486 兔抗人末端(duan)脫氧核苷(gan)酸(suan)轉(zhuan)移(yi)酶多克(ke)隆(long)抗體 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
LOP487 鼠抗人末端(duan)脫氧核苷(gan)酸(suan)轉(zhuan)移(yi)酶單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
LOP488 鼠抗人血小(xiao)板(ban)反應蛋白(bai)單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Thrombospondin（TSP）
LOP489 鼠抗人胸(xiong)苷磷(lin)酸(suan)化(hua)酶單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Thymidine phosphorylase
LOP490 鼠抗人胸(xiong)苷酸(suan)合(he)成(cheng)酶記(ji)單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Thymidylate Synthase/5-Fu Resistance Marker
LOP49 鼠抗人甲(jia)狀腺(xian)球蛋白單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Thyroglobulin（Tg）
LOP492 鼠兔抗人甲(jia)狀腺(xian)球蛋白多克(ke)隆(long)抗體 Thyroglobulin（Tg）
LOP493 鼠抗人甲(jia)狀腺(xian)蛋白單(dan)克(ke)隆(long)抗體 Thyroglobulin（Tg）
LOP494 兔抗人甲(jia)狀腺(xian)蛋白多克(ke)隆(long)抗體 Thyroglobulin（Tg） 、 十(shi)二(er)烷基(ji)硫(liu)

3、 分(fen)離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水(shui)稀釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過濾後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮(suo)膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水稀釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過濾後(hou)40C保(bao)存。這兩種緩沖液必須使(shi)用(yong)Tris堿制(zhi)備，再(zai)用(yong)HCL調(tiao)節PH值(zhi)，而不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨(an)形成自(zi)由基(ji)而(er)加速兩種丙(bing)稀酰(xian)胺(an)的(de)聚(ju)合。PH太(tai)低時，聚(ju)合反(fan)應受到(dao)抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶液。提(ti)供兩種丙(bing)稀酰(xian)胺(an)聚(ju)合所必須的(de)自(zi)由基(ji)。去離(li)子(zi)水配制數ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備用。按(an):或(huo):2比(bi)例與(yu)蛋白質(zhi)樣品混(hun)合，在(zai)沸水終煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳(yong)緩沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極緩沖液。臨(lin)用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液：配制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入200ml甲(jia)醇，加(jia)水至總(zong)量L。

9、 麗(li)春紅(hong)染液儲(chu)存液(ye)：麗春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊# 30g 加(jia)水至00ml 用(yong)時上述儲(chu)存液(ye)稀釋(shi)0倍即成(cheng)麗(li)春紅(hong)S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後(hou)應予以(yi)廢(fei)棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒，戴手(shou)套(tao)操(cao)作(zuo)），溶於磷(lin)#緩沖鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。