【概要描(miao)述(shu)】雞(ji)氣管上皮細胞的相(xiang)關產品(pin)：LL97A(AlMy)(ATCC CCL-191)人肺(fei)成纖(xian)維(wei)細胞兔原代(dai)肝(gan)成纖(xian)維(wei)細胞小鼠(shu)原代(dai)主(zhu)動(dong)脈(mai)外(wai)膜成纖(xian)維(wei)細胞小鼠(shu)原代(dai)輸卵管上皮細胞小鼠(shu)原代(dai)肺(fei)動(dong)脈(mai)內(nei)皮(pi)細胞兔原代(dai)表(biao)皮幹(gan)細胞大鼠(shu)原代(dai)頸(jing)動(dong)脈(mai)成纖(xian)維(wei)細胞兔原代(dai)牙齦上皮(pi)細胞大鼠(shu)原代(dai)膈(ge)肌細胞人原(yuan)代(dai)呼(hu)吸(xi)道(dao)上(shang)皮(pi)細胞

雞(ji)氣管上皮細胞

包(bao)被(bei)條(tiao)件 鼠(shu)尾膠(jiao)原(yuan)Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液頻(pin)率 每(mei)2-3天換(huan)液壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼壁

細胞形態(tai) 上(shang)皮(pi)細胞樣

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可(ke)傳(chuan)1代(dai)

消化液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培養(yang)條件 氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

雞(ji)氣管上皮分離自氣管組織；氣管（Trachea），呼(hu)吸(xi)器官的壹(yi)部(bu)分；為(wei)後壁略(lve)平(ping)的圓(yuan)筒型(xing)管狀。上端(duan)平第(di)六(liu)頸(jing)椎(zhui)下緣，與環(huan)狀軟(ruan)骨(gu)相(xiang)連(lian)；向(xiang)下至(zhi)第(di)四(si)、五(wu)胸(xiong)椎(zhui)體(ti)（相(xiang)當胸(xiong)骨(gu)角(jiao)平(ping)面）交界處(chu)，分(fen)左(zuo)、右(you)主支(zhi)氣管，分叉處稱(cheng)為氣(qi)管杈。氣(qi)管主要由14-16個半(ban)環(huan)狀軟(ruan)骨(gu)構成，有(you)彈性(xing)，軟(ruan)骨(gu)為(wei)“C"字形的軟(ruan)骨(gu)環(huan)，缺口向(xiang)後，各軟(ruan)骨(gu)環(huan)以韌(ren)帶連(lian)接起來(lai)，環(huan)後方缺口處由(you)平滑肌和(he)致密結締(di)組(zu)織連(lian)接，保持(chi)了(le)持(chi)續(xu)張開(kai)狀(zhuang)態(tai)。管腔襯以粘(zhan)膜，表(biao)面覆(fu)蓋(gai)纖毛(mao)上(shang)皮(pi)，粘(zhan)膜分(fen)泌的粘(zhan)液(ye)可(ke)粘(zhan)附吸(xi)入空氣(qi)中(zhong)的灰(hui)塵(chen)顆粒，纖(xian)毛(mao)不(bu)斷(duan)向(xiang)咽(yan)部(bu)擺動(dong)將(jiang)粘(zhan)液(ye)與(yu)灰(hui)塵(chen)排出(chu)，以(yi)凈(jing)化吸(xi)入的氣(qi)體(ti)。氣管上皮是氣(qi)道(dao)與(yu)外(wai)界環(huan)境接觸(chu)的道(dao)防線(xian)，不(bu)僅是(shi)各(ge)種病(bing)原體(ti)、炎癥(zheng)介(jie)質(zhi)作(zuo)用的靶(ba)細胞，還作(zuo)為效應(ying)細胞合成、釋(shi)放(fang)多(duo)種炎(yan)性(xing)介(jie)質(zhi)和(he)細胞因子(zi)從而參與氣(qi)道(dao)炎(yan)癥(zheng)及免(mian)疫反應(ying)。體外(wai)培養(yang)的原(yuan)代(dai)氣(qi)管上皮細胞因與(yu)體內(nei)組(zu)織在(zai)形態(tai)結構和功能活(huo)動上(shang)存(cun)在(zai)很大的相(xiang)似性(xing)，因(yin)此，在(zai)基(ji)礎(chu)及(ji)臨(lin)床(chuang)研(yan)究(jiu)中(zhong)極為(wei)重要。
方法簡(jian)介(jie)：

公司(si)實(shi)驗(yan)室分離的雞(ji)氣管上皮采用中(zhong)性(xing)dan白(bai)酶(mei)-連(lian)酶(mei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)混合消化法(fa)，並通(tong)過上皮(pi)細胞專用培養(yang)基(ji)培養(yang)篩選(xuan)制備而來，細胞總量(liang)約為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢測(ce)：

公司(si)實(shi)驗(yan)室分離的雞(ji)氣管上皮經Cytokeratin-18免(mian)疫(yi)熒(ying)光鑒(jian)定(ding)，純度(du)可(ke)達90%以(yi)上(shang)，且不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體、細菌(jun)、酵(jiao)母和真(zhen)菌(jun)等。

壹(yi)、細胞培養(yang)

1取(qu)材 在(zai)無菌(jun)環(huan)境下從機(ji)體取出(chu)某(mou)種組(zu)織(zhi)細胞（視實(shi)驗(yan)目(mu)的而定），經過壹定(ding)的處(chu)理(li)（如(ru)消化分(fen)散細胞、分離等）後接入培養(yang)器血(xue)中(zhong)，這壹(yi)過程(cheng)稱(cheng)為取材。如(ru)是細胞株的擴大(da)培養(yang)則無(wu)取材這壹(yi)過程(cheng)。機(ji)體取出(chu)的組(zu)織(zhi)細胞的培養(yang)稱為(wei)原代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取(qu)得(de)的組(zu)織(zhi)細胞接入培養(yang)瓶(ping)或(huo)培養(yang)板中(zhong)的過(guo)程(cheng)稱為(wei)培養(yang)。3凍存(cun)及復蘇（可(ke)參閱後面有(you)關章(zhang)節）為了(le)保存細胞，特別是不(bu)易獲得(de)的突變(bian)型(xing)細胞或(huo)細胞株，要將(jiang)細胞凍存(cun)。凍存(cun)的溫(wen)度(du)壹般(ban)用液(ye)氮(dan)的溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細胞收集至(zhi)凍(dong)存(cun)管中(zhong)加入(ru)含(han)保護劑（壹般(ban)為二(er)甲(jia)亞碸(feng)或(huo)甘(gan)油(you)）的培養(yang)基(ji)，以(yi)壹(yi)定(ding)的冷(leng)卻(que)速度(du)凍存(cun)，最終(zhong)保存(cun)於(yu)液氮中(zhong)。在(zai)極低的溫(wen)度(du)下，細胞保存(cun)的時(shi)間(jian)幾乎(hu)是無(wu)限的。復(fu)蘇壹(yi)般(ban)采用快(kuai)融方法，即(ji)從液(ye)氮中(zhong)取出(chu)凍(dong)存管後，立即(ji)放(fang)入(ru)37℃水(shui)中(zhong)，使之(zhi)在(zai)壹分鐘內(nei)迅(xun)速融解。然後將(jiang)細胞轉入(ru)培養(yang)器皿(min)中(zhong)進行(xing)培養(yang)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細胞分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚胎、組織(zhi)器官及外(wai)周(zhou)血(xue)，經特殊分離方法制備而來的原(yuan)初(chu)培養(yang)的細胞稱之(zhi)為原(yuan)代(dai)細胞。1懸浮細胞的分(fen)離方法組(zu)織(zhi)材料(liao)若來(lai)自血液、羊(yang)水、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹(fu)水(shui)的懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的方法是(shi)采(cai)用1000r/min的低(di)速離心(xin)10分鐘(zhong)。經(jing)離心(xin)後由於(yu)各(ge)種細胞的比重不(bu)同可(ke)在(zai)分層液中(zhong)形成不(bu)同層，這樣(yang)可(ke)根(gen)據(ju)需要收獲目(mu)的細胞。2實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料(liao)的分(fen)離方法對(dui)於(yu)實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料(liao)，由於(yu)細胞間(jian)結合緊密，為(wei)了使(shi)組織中(zhong)的細胞充分(fen)分散，形成細胞懸液(ye)，可(ke)采(cai)用機(ji)械(xie)分散法（物理(li)裂(lie)解）和(he)消化分(fen)離法。

三、細胞增殖檢測(ce)技(ji)術

目(mu)前(qian)主要有(you)兩種用於(yu)檢測(ce)細胞增殖能力(li)的方法。壹(yi)種是(shi)直接的方法，通(tong)過(guo)直接測(ce)定進行(xing)分裂(lie)

的細胞數來(lai)評價細胞的增(zeng)殖能力(li)。另(ling)壹種是(shi)間(jian)接的方法，即(ji)細胞活力(li)（cell viability）檢測(ce)方法，通(tong)過(guo)檢測(ce)樣品(pin)中(zhong)健康(kang)細胞的數(shu)目(mu)來評價細胞的增(zeng)殖能力(li)。顯(xian)然，細胞活力(li)檢測(ce)法並不(bu)能最(zui)終證(zheng)明檢測(ce)樣品(pin)中(zhong)的細胞是否(fou)在(zai)增殖。如細胞在(zai)某壹培養(yang)條件下會(hui)自發(fa)啟(qi)動(dong)雕亡程序(xu)，但藥(yao)物的幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制雕亡的發(fa)生(sheng)；這時(shi)若采(cai)用細胞活力(li)檢測(ce)法，顯(xian)然可(ke)以(yi)區分(fen)兩種條(tiao)件下的細胞數量(liang)，但我(wo)們並不(bu)能從藥(yao)物幹擾(rao)組細胞數大(da)於對(dui)照(zhao)組(zu)的事(shi)實(shi)說(shuo)明藥(yao)物可(ke)促(cu)進細胞增殖的結論。所(suo)以(yi)最(zui)直接的證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用方法壹(yi)。

取(qu)材：首(shou)先，用培養(yang)液濕(shi)潤(run)所(suo)取(qu)的組(zu)織(zhi)材料(liao)，並用鋒利(li)的眼(yan)科(ke)剪(jian)去(qu)除附在(zai)其上的脂(zhi)肪和(he)結締(di)組(zu)織。接著用平(ping)衡(heng)液（如PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗(xi)，再用眼(yan)科(ke)彎剪將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪成小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次(ci)用PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗(xi)，直到(dao)液(ye)體(ti)清(qing)亮、無(wu)油(you)滴(di)為(wei)止(zhi)。

接種：用濕(shi)潤(run)的吸(xi)管吸(xi)取切(qie)碎的組(zu)織(zhi)塊，輕輕吹到(dao)培養(yang)瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並按(an)壹(yi)定間(jian)距均勻放(fang)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。註意不(bu)要過多(duo)，確保(bao)組織(zhi)塊切(qie)面貼在(zai)培養(yang)瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。

培養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉，使(shi)瓶(ping)底(di)朝(chao)上(shang)，在(zai)種植(zhi)了(le)組織(zhi)塊壹(yi)側(ce)的對(dui)側(ce)面加足(zu)培養(yang)液，避(bi)免組織塊與培養(yang)液接觸(chu)，然後塞(sai)緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種植(zhi)了(le)組織(zhi)塊的壹(yi)側(ce)朝(chao)上(shang)，靜置於37℃培養(yang)箱中(zhong)。待組(zu)織塊(kuai)貼壁1到(dao)3小時(shi)後翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁的組(zu)織(zhi)塊浸(jin)沒在(zai)培養(yang)液中(zhong)，繼續(xu)靜置。換(huan)液：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天更換(huan)壹次(ci)培養(yang)液，或(huo)者根(gen)據(ju)培養(yang)瓶(ping)種顏(yan)色(se)的變(bian)化(hua)確定(ding)換(huan)液時(shi)間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代(dai)細胞計數

將(jiang)血(xue)球(qiu)計數板及蓋片用擦(ca)試(shi)幹凈(jing)，並將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數板上。

將(jiang)細胞懸液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許(xu)，滴加在(zai)蓋片邊(bian)緣(yuan)，使(shi)懸(xuan)液充滿(man)蓋片和計數板之(zhi)間(jian)。

靜(jing)置3分鐘。

鏡(jing)下觀(guan)察，計算計數板四(si)大格細胞總數(shu)，壓線(xian)細胞只(zhi)計左(zuo)側(ce)和上方的。然後按(an)下式計算：

細胞數/ml＝4大(da)格細胞總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下偶(ou)見(jian)由兩個以上細胞組成的細胞團，應(ying)按(an)單(dan)個細胞計算，若細胞團占(zhan)10%以上(shang)，說明分(fen)散不(bu)好，需重新(xin)制備細胞懸液(ye)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細胞活力(li)

將(jiang)細胞懸液(ye)以0.5ml加入(ru)試(shi)管中(zhong)。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染液(ye)，染色(se)2壹3分鐘(zhong)。

吸(xi)取少許(xu)懸液(ye)塗於(yu)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)，加上(shang)蓋片(pian)。

鏡(jing)下取幾個任意視(shi)野(ye)分(fen)別(bie)計死細胞和活(huo)細胞數，計細胞活力(li)。

死(si)細胞能被(bei)臺盼蘭(lan)染上(shang)色，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色(se)的細胞，活細胞不(bu)被(bei)染色(se)，鏡下呈(cheng)無(wu)色透(tou)明狀(zhuang)。

活(huo)力(li)測(ce)定可(ke)以(yi)和細胞計數合起來(lai)進行(xing)，但要考慮(lv)到(dao)染液(ye)對(dui)原(yuan)細胞懸液(ye)的加倍稀釋(shi)作(zuo)用。