【概要描(miao)述(shu)】雞(ji)外周血單核(he)細(xi)胞(bao)的相(xiang)關(guan)產品(pin)：NCI-H226-LUC-PURO人肺(fei)鱗癌細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代腹(fu)腔(qiang)主(zhu)動(dong)脈(mai)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代嗅鞘細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代肌(ji)腱(jian)成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代腸(chang)系(xi)膜(mo)動脈(mai)平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)大鼠(shu)原代小(xiao)腸(chang)平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代膈肌(ji)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代結膜(mo)成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代角膜(mo)上皮(pi)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原代脈(mai)絡(luo)膜(mo)微血(xue)管平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)

雞(ji)外(wai)周血單核(he)細(xi)胞(bao)

培(pei)養基 含(han)FBS、生(sheng)長添加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻率(lv) 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹次

生(sheng)長特性 貼壁(bi)

細(xi)胞(bao)形態 巨噬細(xi)胞(bao)樣

傳代特性 不增殖；不傳代

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶(mei)

培(pei)養條(tiao)件 氣相(xiang)：空(kong)氣，95%；CO2，5%

雞(ji)外(wai)周血單核(he)分離(li)自(zi)外周血；外(wai)周血是(shi)除(chu)骨(gu)髓(sui)之(zhi)外的血液(ye)，臨(lin)床上常(chang)用壹些(xie)方法(fa)把骨(gu)髓(sui)中(zhong)的造(zao)血幹細(xi)胞(bao)釋放到(dao)血(xue)液(ye)中，再(zai)在從(cong)血(xue)液(ye)中提(ti)取分離(li)得(de)到(dao)造(zao)血幹細(xi)胞(bao)，我們(men)把這樣得(de)到(dao)的(de)幹細(xi)胞(bao)稱(cheng)為(wei)外周血幹細(xi)胞(bao)，在二(er)十(shi)壹世紀(ji)初(chu)人類(lei)開始(shi)的(de)生命方舟計劃(hua)中(zhong)提(ti)出(chu)外(wai)周血這(zhe)壹新概念(nian)。單核(he)細(xi)胞(bao)起源(yuan)於骨(gu)髓(sui)中(zhong)的造(zao)血幹細(xi)胞(bao)，並(bing)在骨(gu)髓(sui)中(zhong)發(fa)育(yu)。當它(ta)們(men)從骨(gu)髓(sui)進(jin)入(ru)血(xue)液(ye)時(shi)仍(reng)然(ran)是(shi)尚未(wei)成(cheng)熟的細(xi)胞(bao)。與其他血細(xi)胞(bao)比(bi)較(jiao)，單核(he)細(xi)胞(bao)內含(han)有(you)更多(duo)的非特異(yi)性脂(zhi)酶(mei)，並(bing)且(qie)具(ju)有(you)更強的吞噬作(zuo)用。單核(he)細(xi)胞(bao)在血(xue)液(ye)中停(ting)留2-3天(tian)後(hou)遷移到(dao)周圍(wei)組織(zhi)中，細(xi)胞(bao)體(ti)積(ji)繼(ji)續增(zeng)大(da)，直(zhi)徑可(ke)達(da)50-80μm，細(xi)胞(bao)內所含(han)的(de)溶酶(mei)體(ti)顆粒(li)和線(xian)粒(li)體(ti)的(de)數(shu)目(mu)也(ye)增多，成(cheng)為(wei)成(cheng)熟的細(xi)胞(bao)。固定在組(zu)織(zhi)中的(de)單核(he)細(xi)胞(bao)稱(cheng)為(wei)組織(zhi)巨噬細(xi)胞(bao)，它(ta)們(men)經常(chang)大量(liang)存(cun)在於(yu)淋(lin)巴(ba)結、肺(fei)泡壁(bi)、骨(gu)髓(sui)、肝和脾等(deng)器(qi)官。激(ji)活(huo)了的(de)單核(he)細(xi)胞(bao)和組(zu)織(zhi)巨噬細(xi)胞(bao)能生(sheng)成(cheng)並(bing)釋放多種細(xi)胞(bao)毒、幹擾(rao)素(su)和白(bai)細(xi)胞(bao)介素(su)，參與機(ji)體(ti)防(fang)衛機(ji)制，還(hai)產生(sheng)壹些(xie)能促進(jin)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)和平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)生長的因子(zi)。在炎(yan)癥(zheng)周圍(wei)單核(he)細(xi)胞(bao)能進(jin)行細(xi)胞(bao)分裂(lie)，並(bing)包圍(wei)異(yi)物(wu)。
方(fang)法(fa)簡介：

公(gong)司實驗室(shi)分離(li)的(de)雞外(wai)周血單核(he)采(cai)用(yong)密度梯度(du)離(li)心法(fa)結合差(cha)速(su)貼壁(bi)法(fa)制備而(er)來，細(xi)胞(bao)總量約為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質量檢(jian)測(ce)：

公(gong)司實驗室(shi)分離(li)的(de)雞外(wai)周血單核(he)經CD14免(mian)疫(yi)熒(ying)光鑒(jian)定，純度可達(da)90%以上，且不含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹、細(xi)胞(bao)培(pei)養

1取材 在無(wu)菌(jun)環(huan)境(jing)下從機(ji)體(ti)取出某(mou)種組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實驗目(mu)的(de)而定），經過(guo)壹定的處理(li)（如(ru)消(xiao)化分散(san)細(xi)胞(bao)、分離(li)等(deng)）後(hou)接入(ru)培(pei)養器血(xue)中，這(zhe)壹過(guo)程稱(cheng)為(wei)取材。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養則無(wu)取材這(zhe)壹過(guo)程。機(ji)體(ti)取出的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)的培(pei)養稱(cheng)為(wei)原代(dai)培(pei)養。2培(pei)養 將取得的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)接入(ru)培(pei)養瓶或培(pei)養板(ban)中(zhong)的(de)過(guo)程稱(cheng)為(wei)培(pei)養。3凍存(cun)及(ji)復(fu)蘇（可參閱(yue)後(hou)面有(you)關(guan)章節）為(wei)了保(bao)存細(xi)胞(bao)，特別是(shi)不易獲(huo)得的突變(bian)型(xing)細(xi)胞(bao)或細(xi)胞(bao)株(zhu)，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的(de)溫(wen)度(du)壹般用(yong)液(ye)氮的(de)溫(wen)度(du)－196℃，將細(xi)胞(bao)收集(ji)至(zhi)凍存(cun)管(guan)中加入含(han)保(bao)護劑(ji)（壹般為(wei)二甲(jia)亞碸或甘(gan)油(you)）的(de)培(pei)養基，以壹定的冷卻(que)速(su)度凍存(cun)，最(zui)終保存(cun)於(yu)液(ye)氮中(zhong)。在極(ji)低的溫(wen)度(du)下，細(xi)胞(bao)保存(cun)的時(shi)間(jian)幾乎是(shi)無(wu)限(xian)的(de)。復蘇壹般采(cai)用(yong)快融(rong)方法(fa)，即從液(ye)氮中(zhong)取出凍存(cun)管(guan)後(hou)，立(li)即放入37℃水(shui)中，使(shi)之在壹分鐘(zhong)內(nei)迅(xun)速(su)融(rong)解。然(ran)後(hou)將細(xi)胞(bao)轉入(ru)培(pei)養器皿(min)中(zhong)進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)分離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎、組織(zhi)器官(guan)及(ji)外(wai)周血，經(jing)特殊分離(li)方(fang)法(fa)制備而(er)來的(de)原(yuan)初(chu)培(pei)養的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為(wei)原代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸浮(fu)細(xi)胞(bao)的分離(li)方(fang)法(fa)組織(zhi)材料(liao)若來(lai)自(zi)血液(ye)、羊(yang)水(shui)、胸水(shui)或腹(fu)水(shui)的懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的方(fang)法(fa)是(shi)采(cai)用(yong)1000r/min的低速(su)離(li)心10分鐘(zhong)。經(jing)離(li)心後(hou)由(you)於(yu)各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的比(bi)重不同可在分層液(ye)中形(xing)成(cheng)不同層，這(zhe)樣可(ke)根據(ju)需要收(shou)獲(huo)目(mu)的(de)細(xi)胞(bao)。2實體(ti)組(zu)織(zhi)材料(liao)的分離(li)方(fang)法(fa)對於(yu)實體(ti)組(zu)織(zhi)材料(liao)，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間(jian)結合緊(jin)密(mi)，為(wei)了使(shi)組織(zhi)中的(de)細(xi)胞(bao)充分分散(san)，形成(cheng)細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可采(cai)用(yong)機(ji)械(xie)分散(san)法(fa)（物(wu)理(li)裂(lie)解(jie)）和(he)消(xiao)化分離(li)法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增殖檢測(ce)技術

目(mu)前主(zhu)要有(you)兩(liang)種用(yong)於檢(jian)測細(xi)胞(bao)增殖能力(li)的(de)方(fang)法(fa)。壹種是(shi)直(zhi)接(jie)的(de)方(fang)法(fa)，通過(guo)直接(jie)測定進(jin)行分裂(lie)

的(de)細(xi)胞(bao)數來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能力(li)。另壹種是(shi)間(jian)接(jie)的方法(fa)，即細(xi)胞(bao)活(huo)力（cell viability）檢(jian)測方法(fa)，通過(guo)檢測(ce)樣品(pin)中健(jian)康細(xi)胞(bao)的數(shu)目(mu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能力(li)。顯(xian)然(ran)，細(xi)胞(bao)活(huo)力檢(jian)測法(fa)並(bing)不能最(zui)終證明(ming)檢(jian)測樣品(pin)中的(de)細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在增(zeng)殖。如(ru)細(xi)胞(bao)在某(mou)壹培(pei)養條(tiao)件下會自(zi)發(fa)啟(qi)動(dong)雕(diao)亡(wang)程序(xu)，但(dan)藥(yao)物(wu)的幹擾(rao)可(ke)抑制雕亡(wang)的發(fa)生；這(zhe)時(shi)若(ruo)采(cai)用(yong)細(xi)胞(bao)活(huo)力檢(jian)測法(fa)，顯(xian)然(ran)可以區(qu)分兩(liang)種條(tiao)件下的細(xi)胞(bao)數量(liang)，但(dan)我(wo)們(men)並(bing)不能從(cong)藥(yao)物(wu)幹擾(rao)組(zu)細(xi)胞(bao)數大(da)於對照組的事實說明藥(yao)物(wu)可促(cu)進(jin)細(xi)胞(bao)增殖的結論。所以最(zui)直(zhi)接的證據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用(yong)方法(fa)壹。

取材：首(shou)先，用培(pei)養液(ye)濕(shi)潤所取的組(zu)織(zhi)材料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利(li)的(de)眼(yan)科(ke)剪(jian)去除附在其上的脂(zhi)肪(fang)和結締組(zu)織(zhi)。接著(zhe)用(yong)平衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再(zai)用眼科(ke)彎(wan)剪(jian)將(jiang)組織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直(zhi)到(dao)液(ye)體(ti)清亮、無(wu)油(you)滴為(wei)止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用濕(shi)潤的(de)吸(xi)管(guan)吸取切碎的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕吹到(dao)培(pei)養瓶皿(min)中(zhong)，並(bing)按(an)壹定間(jian)距均勻(yun)放在培(pei)養瓶底(di)壁上。註意不要過(guo)多，確保(bao)組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面貼在培(pei)養瓶底(di)壁上。

培(pei)養：將培(pei)養瓶翻(fan)轉，使(shi)瓶底朝上，在種(zhong)植(zhi)了組(zu)織(zhi)塊(kuai)壹側的(de)對(dui)側面加足(zu)培(pei)養液(ye)，避免(mian)組(zu)織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養液(ye)接觸，然(ran)後(hou)塞緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將種植(zhi)了組(zu)織(zhi)塊(kuai)的(de)壹側朝上，靜(jing)置(zhi)於37℃培(pei)養箱(xiang)中。待(dai)組織(zhi)塊(kuai)貼壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時(shi)後(hou)翻瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的組織(zhi)塊(kuai)浸沒(mei)在培(pei)養液(ye)中，繼(ji)續靜(jing)置(zhi)。換液(ye)：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天(tian)更換(huan)壹次培(pei)養液(ye)，或者根據(ju)培(pei)養瓶種(zhong)顏色的變(bian)化確定換液(ye)時(shi)間(jian)。

壹、原代(dai)細(xi)胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血(xue)球計(ji)數板(ban)及(ji)蓋(gai)片用(yong)擦試幹凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片蓋(gai)在計(ji)數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)吸出(chu)少許(xu)，滴加在蓋(gai)片邊(bian)緣(yuan)，使懸(xuan)液(ye)充滿(man)蓋片和(he)計數板(ban)之(zhi)間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡(jing)下觀(guan)察(cha)，計(ji)算計(ji)數板(ban)四(si)大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總數，壓(ya)線(xian)細(xi)胞(bao)只計(ji)左(zuo)側(ce)和上方的(de)。然(ran)後(hou)按(an)下式計(ji)算：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總數/ 4×10000

註意：鏡下偶見由(you)兩(liang)個以上細(xi)胞(bao)組成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單個細(xi)胞(bao)計算，若(ruo)細(xi)胞(bao)團占(zhan)10%以上，說明(ming)分散(san)不好，需重新(xin)制備細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)以0.5ml加入試(shi)管(guan)中。

加入0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭染液(ye)，染色2壹3分鐘(zhong)。

吸(xi)取少許(xu)懸液(ye)塗於(yu)載(zai)玻(bo)片上，加上蓋片。

鏡(jing)下取幾個任意(yi)視(shi)野(ye)分別計死細(xi)胞(bao)和活(huo)細(xi)胞(bao)數，計(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力。

死(si)細(xi)胞(bao)能被(bei)臺盼(pan)蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不被染色，鏡下呈無(wu)色透明狀。

活(huo)力測(ce)定可以和(he)細(xi)胞(bao)計數(shu)合起(qi)來(lai)進(jin)行，但(dan)要考(kao)慮到(dao)染液(ye)對原(yuan)細(xi)胞(bao)懸液(ye)的加倍(bei)稀釋作用(yong)。