【概要(yao)描(miao)述(shu)】雞(ji)外周(zhou)血(xue)淋(lin)巴細(xi)胞的(de)相關(guan)產(chan)品(pin)：MSTO-211H (STR)人(ren)肺癌細(xi)胞(bao)小鼠(shu)原代腸巨(ju)噬(shi)細胞(bao)大鼠(shu)原代外根鞘細胞(bao)大(da)鼠原代(dai)鼓膜(mo)上皮(pi)幹(gan)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原代(dai)視網膜(mo)微(wei)血管周細(xi)胞人(ren)原代(dai)晶(jing)狀(zhuang)體(ti)上皮(pi)細胞(bao)大鼠(shu)骨骼(ge)肌(ji)衛星細胞(bao)人(ren)原代(dai)食(shi)管(guan)平滑(hua)肌(ji)細胞(bao)人(ren)原代(dai)小(xiao)氣(qi)道上皮(pi)細胞(bao)兔原(yuan)代(dai)脈絡膜(mo)成纖(xian)維(wei)細胞(bao)

雞(ji)外周(zhou)血(xue)淋(lin)巴細(xi)胞

培(pei)養基 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻率 每(mei)2-3天(tian)換液壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特(te)性(xing) 懸(xuan)浮(fu)

細胞形(xing)態(tai) 圓(yuan)形(xing)

傳代特(te)性(xing) 不(bu)增殖；不(bu)傳(chuan)代

消化液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培(pei)養條件 氣(qi)相：空(kong)氣，95%；CO2，5%

雞(ji)外周(zhou)血(xue)淋(lin)巴分(fen)離(li)自外周(zhou)血(xue)；所謂的(de)外周(zhou)血(xue)，即(ji)除(chu)骨(gu)髓(sui)之(zhi)外的(de)血液，就(jiu)是(shi)已經(jing)被(bei)造(zao)血器官釋(shi)放入循環(huan)系(xi)統(tong)參(can)與循環(huan)的(de)血，它(ta)區別於(yu)造血器官內(nei)的(de)未成熟的(de)血細胞或未被(bei)釋(shi)放入(ru)循環(huan)的(de)血細胞。外周(zhou)血(xue)淋(lin)巴細(xi)胞（Peripheral Blood Lymphocyte）簡稱PBL，主(zhu)要(yao)是(shi)血液循(xun)環(huan)中(zhong)的(de)淋(lin)巴細(xi)胞，由T細胞和B細(xi)胞(bao)組成，其(qi)中(zhong)T細胞(bao)（占(zhan)70%～80%）和B細(xi)胞(bao)（占(zhan)20%～30%）。
方(fang)法(fa)簡(jian)介：

公司實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離(li)的(de)雞(ji)外周(zhou)血(xue)淋(lin)巴采(cai)用取(qu)外周(zhou)血(xue)、通(tong)過密(mi)度梯度離(li)心法制(zhi)備(bei)而來，細胞總量約為1×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢(jian)測：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離(li)的(de)雞(ji)外周(zhou)血(xue)淋(lin)巴經(jing)過檢(jian)測，且不含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體、細菌、酵(jiao)母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹、細胞(bao)培(pei)養

1取(qu)材(cai) 在無(wu)菌環(huan)境下(xia)從(cong)機體取(qu)出某種(zhong)組織(zhi)細胞(bao)（視實(shi)驗(yan)目的(de)而定），經(jing)過壹定的(de)處(chu)理（如(ru)消化分(fen)散細(xi)胞、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接(jie)入培(pei)養器血中(zhong)，這壹(yi)過程稱為取(qu)材(cai)。如是(shi)細胞株(zhu)的(de)擴大培(pei)養則無(wu)取(qu)材(cai)這壹過程。機體(ti)取(qu)出的(de)組織(zhi)細胞(bao)的(de)培(pei)養稱為原(yuan)代培(pei)養。2培(pei)養 將(jiang)取(qu)得的(de)組織(zhi)細胞(bao)接(jie)入培(pei)養瓶或培(pei)養板(ban)中(zhong)的(de)過程稱為培(pei)養。3凍存(cun)及復(fu)蘇（可(ke)參閱(yue)後(hou)面(mian)有(you)關(guan)章(zhang)節）為了(le)保存(cun)細胞，特(te)別是(shi)不易獲得的(de)突變(bian)型(xing)細(xi)胞(bao)或細胞(bao)株(zhu)，要(yao)將(jiang)細胞凍存(cun)。凍存(cun)的(de)溫度壹般(ban)用液(ye)氮的(de)溫度－196℃，將(jiang)細胞收集至(zhi)凍(dong)存(cun)管中(zhong)加(jia)入(ru)含保護劑(ji)（壹(yi)般(ban)為二甲亞(ya)碸或甘油(you)）的(de)培(pei)養基，以壹(yi)定的(de)冷卻(que)速度凍存(cun)，最終(zhong)保存(cun)於液氮(dan)中(zhong)。在極低的(de)溫度下，細(xi)胞(bao)保存(cun)的(de)時(shi)間(jian)幾乎(hu)是(shi)無(wu)限的(de)。復(fu)蘇壹般(ban)采用(yong)快融方(fang)法(fa)，即(ji)從(cong)液氮中(zhong)取(qu)出凍存(cun)管後，立(li)即(ji)放入37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之(zhi)在(zai)壹分(fen)鐘內(nei)迅速融解(jie)。然後將(jiang)細胞轉入(ru)培(pei)養器皿中(zhong)進行(xing)培(pei)養。

二、原代細胞(bao)分(fen)離(li)

凡是(shi)來源(yuan)於胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器官及(ji)外周(zhou)血(xue)，經(jing)特(te)殊(shu)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)制(zhi)備(bei)而來的(de)原初培(pei)養的(de)細胞稱之(zhi)為原(yuan)代細胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)的(de)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)組織(zhi)材料若(ruo)來(lai)自血液、羊(yang)水(shui)、胸(xiong)水(shui)或腹水(shui)的(de)懸液材料，的(de)方(fang)法(fa)是(shi)采用1000r/min的(de)低速離(li)心10分(fen)鐘。經(jing)離(li)心後由於各(ge)種(zhong)細胞(bao)的(de)比重不同可(ke)在分(fen)層液(ye)中(zhong)形(xing)成不(bu)同層，這樣可(ke)根據需要(yao)收獲目的(de)細胞。2實體組織(zhi)材料的(de)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)對(dui)於實(shi)體(ti)組織(zhi)材料，由(you)於(yu)細胞間(jian)結合緊(jin)密，為了(le)使(shi)組織(zhi)中(zhong)的(de)細胞充(chong)分(fen)分(fen)散，形(xing)成細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可(ke)采用機械分(fen)散法(fa)（物理裂(lie)解(jie)）和消(xiao)化分(fen)離(li)法(fa)。

三、細胞增殖檢(jian)測技術(shu)

目前(qian)主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種(zhong)用於(yu)檢(jian)測細胞增殖能力(li)的(de)方(fang)法(fa)。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接(jie)的(de)方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)直接(jie)測定進行(xing)分(fen)裂

的(de)細胞數來評(ping)價(jia)細胞的(de)增殖能力(li)。另壹(yi)種(zhong)是(shi)間接(jie)的(de)方(fang)法(fa)，即(ji)細(xi)胞活(huo)力（cell viability）檢(jian)測方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)檢(jian)測樣品(pin)中(zhong)健康(kang)細胞的(de)數目來評(ping)價(jia)細胞的(de)增殖能力(li)。顯然，細胞活(huo)力檢(jian)測法並不能最終(zhong)證明(ming)檢(jian)測樣品(pin)中(zhong)的(de)細胞是(shi)否在增殖。如(ru)細(xi)胞在(zai)某壹(yi)培(pei)養條件下會(hui)自發啟動雕(diao)亡(wang)程序，但(dan)藥(yao)物(wu)的(de)幹(gan)擾可(ke)抑制(zhi)雕(diao)亡(wang)的(de)發生(sheng)；這(zhe)時(shi)若(ruo)采用(yong)細胞活(huo)力檢(jian)測法，顯然可(ke)以區分(fen)兩種(zhong)條件下的(de)細胞數量，但我(wo)們並(bing)不能從(cong)藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組細胞(bao)數大於(yu)對(dui)照組的(de)事實(shi)說明藥(yao)物(wu)可(ke)促(cu)進細(xi)胞(bao)增殖的(de)結論。所以最直接(jie)的(de)證據應該(gai)采(cai)用(yong)方(fang)法(fa)壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首先，用培(pei)養液濕潤(run)所取(qu)的(de)組織(zhi)材料，並(bing)用(yong)鋒利(li)的(de)眼科剪(jian)去除(chu)附(fu)在其上的(de)脂肪和結締組織(zhi)。接(jie)著用(yong)平衡(heng)液（如PBS或Hanks液）漂(piao)洗，再(zai)用眼科彎(wan)剪(jian)將(jiang)組織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成小(xiao)塊(kuai)。多次(ci)用PBS或Hanks液漂(piao)洗，直到液(ye)體(ti)清(qing)亮(liang)、無(wu)油(you)滴(di)為止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用濕潤(run)的(de)吸管吸取(qu)切(qie)碎的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕輕吹(chui)到培(pei)養瓶皿(min)中(zhong)，並按(an)壹(yi)定間距均勻放(fang)在培(pei)養瓶底(di)壁上。註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)過(guo)多(duo)，確保組織(zhi)塊(kuai)切面(mian)貼在培(pei)養瓶底(di)壁上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶翻(fan)轉，使(shi)瓶底(di)朝上，在(zai)種(zhong)植(zhi)了組織(zhi)塊(kuai)壹側(ce)的(de)對(dui)側面(mian)加(jia)足(zu)培(pei)養液，避(bi)免組織(zhi)塊(kuai)與培(pei)養液接(jie)觸，然後塞緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹側朝上，靜(jing)置(zhi)於37℃培(pei)養箱中(zhong)。待組織(zhi)塊(kuai)貼壁1到3小(xiao)時(shi)後(hou)翻(fan)瓶，使(shi)貼壁的(de)組織(zhi)塊(kuai)浸沒(mei)在培(pei)養液中(zhong)，繼續(xu)靜(jing)置(zhi)。換液(ye)：每(mei)隔2到3天(tian)更換壹(yi)次(ci)培(pei)養液，或者(zhe)根據培(pei)養瓶種(zhong)顏(yan)色(se)的(de)變(bian)化確定換液時(shi)間(jian)。

壹、原代細(xi)胞計(ji)數

將(jiang)血球計(ji)數板(ban)及蓋片用擦(ca)試幹(gan)凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋片蓋在計(ji)數板(ban)上。

將(jiang)細胞懸液吸出少(shao)許，滴加(jia)在(zai)蓋片邊緣(yuan)，使(shi)懸液(ye)充(chong)滿(man)蓋片和計(ji)數板(ban)之(zhi)間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡下觀(guan)察，計(ji)算計(ji)數板(ban)四(si)大格(ge)細胞(bao)總數，壓線(xian)細胞(bao)只計(ji)左側和上方(fang)的(de)。然後按(an)下(xia)式(shi)計(ji)算：

細胞(bao)數/ml＝4大格(ge)細胞(bao)總數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下偶(ou)見(jian)由兩個以上細(xi)胞組成的(de)細胞團，應按(an)單個細(xi)胞計(ji)算，若細(xi)胞團(tuan)占(zhan)10%以上，說明分(fen)散不(bu)好，需重(zhong)新制(zhi)備(bei)細胞懸(xuan)液。

二、原代細胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細胞懸液以0.5ml加(jia)入(ru)試管中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染(ran)液，染(ran)色(se)2壹3分(fen)鐘。

吸取(qu)少(shao)許懸液(ye)塗於(yu)載(zai)玻片上，加(jia)上蓋片。

鏡下取(qu)幾(ji)個任意視野(ye)分(fen)別計(ji)死細胞和活(huo)細胞(bao)數，計(ji)細胞活(huo)力。

死細(xi)胞(bao)能被(bei)臺(tai)盼蘭染(ran)上色(se)，鏡下可(ke)見深(shen)蘭色(se)的(de)細胞，活(huo)細胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色(se)，鏡下呈無(wu)色(se)透明狀(zhuang)。

活(huo)力測定可(ke)以和細(xi)胞(bao)計(ji)數合起(qi)來(lai)進行(xing)，但(dan)要(yao)考(kao)慮到染(ran)液(ye)對(dui)原細(xi)胞(bao)懸(xuan)液的(de)加(jia)倍(bei)稀(xi)釋(shi)作(zuo)用。