【概要(yao)描述(shu)】羊抗雞IgG-RBITC抗體(ti),抗體(ti)種類,多種試(shi)劑(ji)現貨供(gong)應(ying)!

羊抗雞IgG-RBITC抗體(ti)*,羊抗雞IgG-RBITC抗體(ti)用於(yu)免疫組(zu)化(hua)實驗(yan)，WB實驗(yan)，相應(ying)的(de)標記抗體(ti)有HRP標記抗體(ti)，FITC標記，BIO等(deng)。

【貯存(cun)條件】： 貯(zhu)存(cun)於(yu)-20℃. 本品(pin)應(ying)在低(di)溫(wen)下保存(cun)，長時間(jian)在暴(bao)露在空(kong)氣(qi)中，含量(liang)會(hui)有所(suo)降(jiang)低(di)。

規(gui)格：0.5ml

材料和(he)方法

　　. 材料 人(ren)成(cheng)骨肉(rou)瘤MG63細(xi)胞為本實驗(yan)室(shi)保存(cun)。重組(zu)質粒MycSSHL(WT)、MycSSHL(S937A S978A/2SA)以(yi)及(ji)recombinant cofilinHis6由(you)王(wang)巖教授惠(hui)贈(zeng)。脂(zhi)質體(ti) 2000( Invitrogen公司)。高(gao)糖DMEM培養(yang)基(美國Gibco 公司)，胎(tai)牛(niu)血清(Hyclone公(gong)司)，和(he)EDTA(Sigma 公司)。A2387，KN93，CaM，重組(zu)Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain，Calbiochem)。抗體(ti)：Myc (9E0;Roche)，HA (3F0;Roche)，Pcofilin，Cofilin(Santa Cruz)， CaMKⅡδδ4 (Trans Genic Inc.)，PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沈(chen)澱(dian)(Protein Gagarose)試(shi)劑(ji)盒(he)(邁(mai)晨(chen)科(ke)技(ji)有(you)限(xian)公(gong)司)。

　　.2 蛋白(bai)印(yin)跡(ji)實驗(yan) MG63細(xi)胞(bao)鋪於(yu)35 mmol/L培養(yang)皿(min)中(zhong)，待(dai)細(xi)胞密度達到(dao)60%～70%時，轉染(ran)MycSSHL，48 h後換無(wu)血清培養(yang)基培養(yang)3 h，分(fen)別加入(ru)濃度為0.5，，2.5，5 μmol/L的(de)A2387孵育(yu)0 min後裂(lie)解細(xi)胞，離心(xin)取上(shang)清(qing)加入(ru)凝膠加樣(yang)緩(huan)沖液(ye),沸(fei)水(shui)浴(yu)上(shang)加熱(re)5 min，上(shang)樣(yang)、電(dian)泳、轉膜、雜(za)交〔壹(yi)抗分別為(wei)Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及(ji)CaMK Ⅱ δ(4)〕、ECL顯(xian)色。

　　.3 體(ti)外(wai)激酶測(ce)定(ding) MycSSHL(WT)及(ji)其(qi)突變(bian)體(ti)MycSSHL(2 SA)分別轉(zhuan)染(ran)至MG63細胞(bao)，48 h後采用(yong)免疫共沈(chen)澱(dian)(Protein Gagarose)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)方法及(ji)抗cmyc抗體(ti)，對照(zhao)組(zu)為(wei)抗IgG抗體(ti)。回收MycSSHL，加入(ru)0.6 μg/ml重(zhong)組(zu)活性CaMKⅡ(單獨(du)或(huo)同時加入(ru)抑(yi)制(zhi)劑(ji)KN93)以(yi)及(ji)00 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 於(yu) 20 μl 激酶反應(ying)緩(huan)沖液(ye)中(zhong)，30℃反(fan)應(ying)40 min。反(fan)應(ying)產(chan)物(wu)進(jin)行(xing)SDSPAGE電(dian)泳、轉膜，應(ying)用(yong)放(fang)射(she)自顯(xian)影技(ji)術檢測(ce)32P 標(biao)記的(de)SSHL水(shui)平。

　　.4 體(ti)外(wai)SSHL磷(lin)酸(suan)酶(mei)活性測(ce)定(ding)實驗(yan) MycSSHL(WT)或(huo)MycSSHL (2 SA)轉(zhuan)染至MG63細胞(bao)，48 h後，采用(yong)免疫共沈(chen)澱(dian)(Protein Gagarose)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)方法及(ji)抗cmyc抗體(ti)，對照(zhao)組(zu)為(wei)抗IgG抗體(ti)。回收MycSSHL，加入(ru)0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨(du)或(huo)同時加入(ru)抑(yi)制(zhi)劑(ji)KN93)，20 μg/ml CaM，以(yi)及(ji) 6.3 μg/ml cofilinHis6 於(yu) 20 μl 反應(ying)緩(huan)沖液(ye)(50 mol/L HEPES，pH 7.4，0. mol/L CaCl2，0.5 mol/L EDTA，3 mol/L MgCl2，00 mmol/L NaCl， mol/L dithiothreitol，0.5 mg/ml BSA， μg/ml leupeptin),中(zhong)30℃反(fan)應(ying)2 h。反(fan)應(ying)產(chan)物(wu)進(jin)行(xing)SDSPAGE電(dian)泳、轉膜、雜(za)交(壹(yi)抗分別為(wei)Pcofilin，Cofilin， cmyc 抗體(ti))、ECL顯(xian)色。

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