【概(gai)要(yao)描述(shu)】BCA蛋(dan)白(bai)質(zhi)定量(liang)試劑盒 Western免疫印跡(ji)(Western Blot)是將蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗(kang)體進行(xing)檢測。

BCA蛋(dan)白(bai)質(zhi)定量(liang)試劑盒   Western Blot技術: 做線(xian)粒(li)體膜UCP2蛋(dan)白(bai)的(de)Western Blot （以下簡寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取(qu)線(xian)粒(li)體後凍(dong)存(cun)（未(wei)加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑），樣(yang)品(pin)不(bu)能(neng)反(fan)復凍(dong)融(rong);，加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑。同(tong)時(shi)，建(jian)議(yi)檢查(zha)Western Blot過(guo)程(cheng)， 提(ti)高壹(yi)抗濃(nong)度(du)。對於(yu)加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑來(lai)說，壹(yi)般加(jia)PMSF就可(ke)以了，能多加(jia)幾中種蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能(neng)同(tong)時(shi)進行(xing)兩種因子(zi)的(de)Western Blot檢測，有(you)的(de)甚至(zhi)可(ke)以同時測幾(ji)十(shi)種樣(yang)品(pin)。
BCA蛋(dan)白(bai)質(zhi)定量(liang)試劑盒如(ru)果(guo)是膜蛋(dan)白(bai)和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白(bai)，所(suo)用(yong)的(de)去垢(gou)劑就要(yao)溫和(he)得多，這時加上(shang)NaF去抑制磷#化酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)。
樣(yang)品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量很低，每(mei)微(wei)升不(bu)到(dao)微(wei)克，但是(shi)在轉(zhuan)膜時(shi)經(jing)常(chang)會發現(xian)只(zhi)有壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到(dao)了(le)膜上(shang)，就是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜後(hou)染膠(jiao)發現(xian)有的(de)孔(kong)所(suo)有(you)的(de)蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶(dai)都(dou)在(zai)，只(zhi)是顏色(se)變(bian)淡了(le)，可(ke)以加大(da)上樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可(ke)以用減(jian)少電(dian)流(liu)延(yan)長時(shi)間(jian)，多加(jia)5-0%甲醇(chun)。
想分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是(shi)分(fen)子(zi)量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的(de)分(fen)離(li)膠(jiao)濃度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好(hao)做(zuo)
如(ru)果(guo)上樣(yang)量(liang)超(chao)載(zai)，可(ke)以濃縮樣(yang)品(pin)，也(ye)可(ke)以根據(ju)妳(ni)的(de)目標(biao)分(fen)子(zi)量(liang)透(tou)析掉(diao)壹(yi)部分(fen)小分子(zi)蛋(dan)白(bai)。壹(yi)般地(di)，超(chao)載(zai)30%是(shi)不(bu)會有問(wen)題(ti)的(de)。如(ru)果(guo)已經(jing)超了(le)不(bu)少了，而(er)且(qie)小分子(zi)量(liang)的(de)也(ye)要(yao)，可(ke)以考(kao)慮加(jia)大(da)膠(jiao)的(de)厚(hou)度(du)，可(ke)以試試.5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後存(cun)放(fang)-80℃，壹(yi)兩年沒有(you)問(wen)題(ti)，zui關(guan)鍵(jian)兩條(tiao)：不(bu)要(yao)被(bei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)水解掉;不(bu)要(yao)被(bei)細(xi)菌消(xiao)化(hua)掉(diao)（也(ye)是被(bei)酶(mei)水解了）。
采(cai)用DAB顯色(se)技(ji)術，二抗(kang)是(shi)化的(de)多克隆(long)抗體，三(san)抗(kang)是親和(he)素(su)體系(xi)，不(bu)能(neng)使用脫(tuo)脂奶粉，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)會影響親和(he)素(su)的(de)生(sheng)成(cheng)，因為脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)中含(han)，用BSA代替(ti)應(ying)該好(hao)壹(yi)點.
Western Blot壹(yi)般上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克不(bu)等(deng)，結果(guo)跟目的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐度(du)、上樣(yang)量(liang)、壹(yi)二抗(kang)的(de)量(liang)和(he)撫(fu)育(yu)時(shi)間(jian)都(dou)有(you)關(guan)系(xi)，也(ye)與顯色(se)時(shi)間(jian)長短有(you)關(guan)。開(kai)始(shi)摸條(tiao)件時(shi)，為(wei)了(le)拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結果(guo)，各個步驟都(dou)可(ke)以量多壹(yi)點時(shi)間(jian)長壹(yi)點，當(dang)然(ran)背(bei)景也(ye)就出(chu)來(lai)了。要(yao)拿(na)到(dao)好(hao)的(de)結果(guo)，如(ru)果(guo)抗體好(hao)的(de)話(hua)比(bi)較(jiao)容(rong)易(yi)，抗(kang)體不(bu)好(hao)的(de)話(hua)就需(xu)要(yao)反(fan)復地(di)試(shi)了，當(dang)然(ran)有(you)的(de)不(bu)適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做(zuo)也(ye)不(bu)行(xing)。所以拿(na)到(dao)好(hao)的(de)結果(guo)不(bu)容(rong)易(yi)。

壹(yi)、 原理(li)

與Southern或(huo)Northern雜交方法類似，但Western Blot采(cai)用的(de)是(shi)聚(ju)丙烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被(bei)檢測物(wu)是蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是抗(kang)體，“顯色(se)”用標(biao)記(ji)的(de)二抗(kang)。經(jing)過(guo)PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固(gu)相載(zai)體（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄膜）上，固(gu)相載(zai)體以非共價(jia)鍵形式(shi)吸(xi)附(fu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且(qie)能保(bao)持(chi)電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的(de)多肽(tai)類型及其(qi)生(sheng)物學(xue)活(huo)性(xing)不(bu)變(bian)。以固(gu)相載(zai)體上的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多肽(tai)作(zuo)為抗(kang)原，與對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體起免(mian)疫反(fan)應(ying)，再(zai)與酶(mei)或(huo)同位(wei)素(su)標(biao)記(ji)的(de)第二抗(kang)體起反(fan)應(ying)，經(jing)過(guo)底物顯色(se)或(huo)放(fang)射自(zi)顯影以檢測電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的(de)特(te)異(yi)性(xing)目的(de)基(ji)因表(biao)達的(de)蛋(dan)白(bai)成(cheng)分。該(gai)技術也(ye)廣泛(fan)應(ying)用於(yu)檢測蛋(dan)白(bai)水平(ping)的(de)表(biao)達。

二、分(fen)類    現(xian)常(chang)用的(de)有(you)底物化學(xue)發光(guang)ECL和底物DAB呈(cheng)色(se)，體同水平(ping)和實(shi)驗條(tiao)件的(de)是(shi)用(yong)*種(zhong)方法，目前發(fa)表(biao)文(wen)章(zhang)通常(chang)是用(yong)底物化學(xue)發光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買現(xian)成(cheng)的(de)試(shi)劑盒就行(xing)，操(cao)作也(ye)比較(jiao)簡單(dan)，原理(li)如(ru)下(xia)（二抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應(ying)底物為過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾(nuo)，如(ru)遇到(dao)HRP，即發(fa)光(guang)，可(ke)使(shi)膠(jiao)片(pian)曝光(guang)，就可(ke)洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主(zhu)要(yao)試劑

、 丙烯(xi)酰胺(an)和N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯(xi)酰胺(an)，應(ying)以溫熱（以利於(yu)溶(rong)解雙(shuang)丙稀(xi)酰胺(an)）的(de)去離(li)子(zi)水配制含(han)有29%（w/v）丙稀(xi)酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯(xi)酰胺(an)儲存(cun)液(ye)丙稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲叉(cha)雙(shuang)丙稀(xi)酰胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕色(se)瓶，4℃避光(guang)保(bao)存(cun)。嚴格核(he)實(shi)PH不(bu)得超過(guo)7.0，因可(ke)以發生脫氨(an)基(ji)反(fan)應(ying)是光(guang)催化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化的(de)。使(shi)用(yong)期(qi)不(bu)得超過(guo)兩個月(yue)，隔(ge)幾(ji)個月(yue)須重(zhong)新配制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可(ke)以過(guo)濾(lv)。   2、 十(shi)二烷基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水配制，室(shi)溫保(bao)存(cun)。

3、 分離(li)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積(ji)。過(guo)濾(lv)後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積(ji)。過(guo)濾(lv)後40C保(bao)存(cun)。這兩種緩(huan)沖液(ye)必須(xu)使(shi)用Tris堿(jian)制備(bei)，再(zai)用HCL調節(jie)PH值(zhi)，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲基(ji)乙(yi)二胺(an)催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨形(xing)成(cheng)自由(you)基而(er)加(jia)速(su)兩種丙稀(xi)酰胺(an)的(de)聚(ju)合(he)。PH太低(di)時(shi)，聚(ju)合(he)反(fan)應(ying)受到(dao)抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供(gong)兩種丙稀(xi)酰胺(an)聚(ju)合(he)所(suo)必須(xu)的(de)自(zi)由(you)基(ji)。去離(li)子(zi)水配制數ml，臨(lin)用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按(an):或(huo):2比例與蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)混(hun)合，在(zai)沸(fei)水終煮(zhu)3min混(hun)勻後(hou)再(zai)上樣(yang)，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾水溶(rong)解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極(ji)緩(huan)沖液(ye)。臨(lin)用前稀(xi)釋0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)：配制L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並加(jia)入200ml甲醇(chun)，加(jia)水至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春紅染液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗(li)春紅S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺基(ji)水楊(yang)# 30g 加水至(zhi)00ml 用時(shi)上(shang)述(shu)儲存(cun)液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗(li)春紅S使用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後(hou)應(ying)予(yu)以廢棄。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有毒(du)，戴(dai)手(shou)套操(cao)作），溶(rong)於(yu)磷#緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)記(ji)的(de)第二抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二甲基(ji)甲酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二甲基(ji)甲酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。