【概要(yao)描(miao)述(shu)】GST融和(he)蛋(dan)白純化試劑(ji)盒 Western免疫印(yin)跡(ji)(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋(dan)白質轉(zhuan)移(yi)到膜(mo)上(shang)，然(ran)後利(li)用(yong)抗(kang)體進(jin)行檢(jian)測(ce)。

GST融和(he)蛋(dan)白純化試劑(ji)盒    Western Blot技(ji)術(shu): 做線粒體(ti)膜(mo)UCP2蛋(dan)白的Western Blot （以(yi)下簡(jian)寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取線粒體(ti)後(hou)凍存（未加蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)），樣品(pin)不(bu)能反(fan)復凍融;，加(jia)蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)。同時(shi)，建議檢(jian)查(zha)Western Blot過(guo)程， 提(ti)高壹(yi)抗(kang)濃度。對於加蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)來說(shuo)，壹(yi)般(ban)加(jia)PMSF就可(ke)以(yi)了，能(neng)多加(jia)幾中種(zhong)蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)。
同壹(yi)蛋(dan)白樣(yang)品能同時進(jin)行兩種(zhong)因(yin)子(zi)的Western Blot檢(jian)測(ce)，有的甚至可(ke)以(yi)同時(shi)測(ce)幾十種(zhong)樣GST融(rong)和蛋(dan)白純化試劑(ji)盒如果是膜(mo)蛋(dan)白和(he)胞(bao)漿蛋(dan)白，所(suo)用(yong)的去垢(gou)劑就要(yao)溫(wen)和得多(duo)，這(zhe)時加(jia)上(shang)NaF去抑(yi)制磷(lin)#化酶(mei)的活(huo)性。
樣品(pin)的蛋(dan)白含(han)量很(hen)低(di)，每微(wei)升(sheng)不(bu)到微(wei)克(ke)，但(dan)是(shi)在(zai)轉膜(mo)時經(jing)常(chang)會(hui)發現只(zhi)有壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白轉(zhuan)到了膜(mo)上(shang)，就是(shi)在轉(zhuan)膜(mo)後染(ran)膠(jiao)發(fa)現有的孔(kong)所有的蛋(dan)白條(tiao)帶都在，只(zhi)是顏(yan)色變(bian)淡了(le)，可(ke)以(yi)加大(da)上(shang)樣(yang)量，轉(zhuan)移(yi)時可(ke)以(yi)用(yong)減少(shao)電流(liu)延長(chang)時間(jian)，多加(jia)5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分(fen)離(li)的蛋(dan)白是(shi)分(fen)子(zi)量260kd的，SDS-PAGE電泳的分(fen)離(li)膠(jiao)濃(nong)度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋(dan)白不(bu)好(hao)做
如果上(shang)樣(yang)量超(chao)載，可(ke)以(yi)濃縮(suo)樣品(pin)，也(ye)可以(yi)根據(ju)妳(ni)的目(mu)標分(fen)子(zi)量透析(xi)掉(diao)壹(yi)部分(fen)小(xiao)分(fen)子(zi)蛋(dan)白。壹(yi)般(ban)地，超(chao)載30%是(shi)不(bu)會有問題的。如果已經超(chao)了(le)不(bu)少(shao)了，而且小(xiao)分(fen)子(zi)量的也(ye)要(yao)，可(ke)以(yi)考慮加(jia)大(da)膠的厚度，可以(yi)試試.5mm的 comb。
蛋(dan)白變(bian)性後存(cun)放-80℃，壹(yi)兩年沒(mei)有問題，zui關鍵(jian)兩條：不(bu)要(yao)被(bei)蛋(dan)白酶(mei)水(shui)解(jie)掉(diao);不(bu)要(yao)被(bei)細菌(jun)消化(hua)掉(diao)（也(ye)是被(bei)酶(mei)水(shui)解(jie)了(le)）。
采(cai)用(yong)DAB顯色技(ji)術(shu)，二(er)抗(kang)是化(hua)的多(duo)克隆(long)抗(kang)體，三(san)抗(kang)是親(qin)和(he)素體(ti)系(xi)，不(bu)能使(shi)用(yong)脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)，脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)會影響親(qin)和(he)素的生(sheng)成(cheng)，因(yin)為(wei)脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)中含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應該好(hao)壹(yi)點(dian).Western Blot壹(yi)般(ban)上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不(bu)等，結果(guo)跟目(mu)的蛋(dan)白的豐(feng)度、上(shang)樣(yang)量、壹(yi)二抗(kang)的量和(he)撫育時間(jian)都有關系，也(ye)與顯色時(shi)間(jian)長(chang)短有關。開始摸(mo)條件時(shi)，為(wei)了(le)拿(na)到陽性結果(guo)，各個(ge)步(bu)驟都(dou)可(ke)以(yi)量多(duo)壹(yi)點(dian)時間(jian)長(chang)壹(yi)點(dian)，當然(ran)背景(jing)也(ye)就出(chu)來了(le)。要(yao)拿(na)到好(hao)的結果(guo)，如果抗(kang)體好(hao)的話比較容(rong)易，抗(kang)體不(bu)好(hao)的話就需要(yao)反(fan)復地試了(le)，當然有的不(bu)適(shi)合(he)Western Blot的怎(zen)樣做也(ye)不(bu)行。所(suo)以(yi)拿到好(hao)的結果(guo)不(bu)容易。

壹(yi)、 原理(li)

與Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方法(fa)類似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的是(shi)聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)電泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物是(shi)蛋(dan)白質，“探(tan)針”是(shi)抗(kang)體，“顯色”用(yong)標(biao)記的二(er)抗(kang)。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的蛋(dan)白質樣(yang)品，轉移(yi)到固(gu)相(xiang)載體(ti)（例如硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體(ti)以(yi)非共(gong)價鍵(jian)形式吸附蛋(dan)白質，且能(neng)保持(chi)電泳分(fen)離(li)的多(duo)肽類型(xing)及其(qi)生(sheng)物(wu)學(xue)活(huo)性不(bu)變。以(yi)固(gu)相(xiang)載體(ti)上(shang)的蛋(dan)白質或(huo)多肽作(zuo)為抗(kang)原，與對應的抗(kang)體起免疫反(fan)應，再與酶或(huo)同位素(su)標(biao)記的第二抗(kang)體起反(fan)應，經過(guo)底(di)物(wu)顯色或(huo)放射(she)自(zi)顯影以(yi)檢(jian)測(ce)電泳分(fen)離(li)的特異(yi)性目(mu)的基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的蛋(dan)白成(cheng)分(fen)。該技術(shu)也(ye)廣(guang)泛應用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白水(shui)平的表(biao)達(da)。

二、分(fen)類  現常(chang)用(yong)的有底(di)物(wu)化(hua)學發光(guang)ECL和(he)底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體同水(shui)平和實驗(yan)條件的是(shi)用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目(mu)前(qian)發表(biao)文章(zhang)通常(chang)是(shi)用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學發光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現成(cheng)的試劑(ji)盒就行(xing)，操作(zuo)也(ye)比較簡(jian)單，原(yuan)理如下（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記）：反(fan)應底(di)物(wu)為(wei)過(guo)氧化(hua)物(wu)+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如遇到HRP，即(ji)發光，可使膠片曝(pu)光(guang)，就可(ke)洗出(chu)條(tiao)帶。

三(san)、 主要(yao)試劑(ji)

、 丙烯酰(xian)胺和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺，應以(yi)溫熱(re)（以(yi)利(li)於(yu)溶解雙丙稀酰(xian)胺）的去離子(zi)水(shui)配(pei)制含(han)有29%（w/v）丙稀酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液(ye)丙稀酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙丙稀酰(xian)胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避光保存(cun)。嚴(yan)格核(he)實PH不(bu)得超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發生(sheng)脫氨(an)基(ji)反(fan)應是光(guang)催(cui)化或(huo)堿(jian)催(cui)化的。使(shi)用(yong)期(qi)不(bu)得超(chao)過(guo)兩個(ge)月，隔(ge)幾個(ge)月須重(zhong)新配(pei)制。如有沈澱(dian)，可以(yi)過(guo)濾。  2、 十二(er)烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子(zi)水(shui)配(pei)制，室(shi)溫(wen)保(bao)存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮膠緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40C保(bao)存。這兩種(zhong)緩沖(chong)液(ye)必(bi)須使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備(bei)，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值(zhi)，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基(ji)乙(yi)二(er)胺催(cui)化過(guo)硫#銨形成(cheng)自(zi)由(you)基(ji)而加速(su)兩種(zhong)丙稀酰(xian)胺的聚(ju)合。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚(ju)合反(fan)應受(shou)到抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫#胺溶(rong)液(ye)。提(ti)供兩種(zhong)丙稀酰(xian)胺聚(ju)合所(suo)必(bi)須的自(zi)由(you)基(ji)。去離子(zi)水(shui)配(pei)制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備用(yong)。按:或(huo):2比例與蛋(dan)白質樣(yang)品混(hun)合，在(zai)沸水(shui)終煮(zhu)3min混(hun)勻後再上(shang)樣(yang)，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電泳緩(huan)沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶(rong)解(jie)至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電極(ji)緩沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需稱取(qu)2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲(jia)醇，加(jia)水(shui)至(zhi)總(zong)量L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲(chu)存(cun)液(ye)：麗春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上(shang)述(shu)儲存(cun)液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗春(chun)紅(hong)S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後(hou)應予以(yi)廢棄。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有毒，戴手(shou)套(tao)操作(zuo)），溶(rong)於磷#緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶標記的第二抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲基(ji)甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲基(ji)甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。