【概(gai)要(yao)描述】鼠(shu)抗(kang)人(ren)肺(fei)癌(ai)耐(nai)藥蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Lung Cancer Resistance Protein (LRP) Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋(dan)白質轉移到膜(mo)上，然(ran)後利(li)用(yong)抗(kang)體進(jin)行(xing)檢(jian)測。

鼠(shu)抗(kang)人(ren)肺(fei)癌(ai)耐(nai)藥蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Lung Cancer Resistance Protein （LRP）  Western Blot技術(shu):

壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或Northern雜(za)交方法(fa)類(lei)似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用的是聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝膠電(dian)泳(yong)，被檢(jian)測物是(shi)蛋(dan)白質，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色”用(yong)標記(ji)的二(er)抗(kang)。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的蛋(dan)白質樣(yang)品(pin)，轉移(yi)到(dao)固相載體（例(li)如硝#纖(xian)維(wei)素(su)薄膜）上，固相載體以非(fei)共價鍵形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋(dan)白質，且能保持(chi)電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的多肽類(lei)型(xing)及(ji)其(qi)生(sheng)物(wu)學活性(xing)不(bu)變(bian)。以固相載體上的蛋(dan)白質或多肽作(zuo)為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的抗(kang)體起(qi)免(mian)疫(yi)反應，再(zai)與(yu)酶或同位(wei)素(su)標記的第二(er)抗(kang)體起(qi)反應，經過(guo)底(di)物(wu)顯(xian)色或放射(she)自(zi)顯影以檢(jian)測電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的特異性(xing)目的基因(yin)表(biao)達(da)的蛋(dan)白成分。該(gai)技術(shu)也廣泛應用於檢測蛋(dan)白水(shui)平的表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類(lei)鼠(shu)抗(kang)人(ren)肺(fei)癌(ai)耐(nai)藥蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Lung Cancer Resistance Protein （LRP）  現(xian)常用的有底(di)物(wu)化學發(fa)光(guang)ECL和底(di)物DAB呈(cheng)色，體同水(shui)平和實驗(yan)條件的是用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目前(qian)發(fa)表(biao)文章(zhang)通常是用(yong)底物(wu)化學發(fa)光(guang)ECL。只要(yao)買(mai)現(xian)成的試劑(ji)盒(he)就行(xing)，操作(zuo)也比較(jiao)簡單(dan)，原(yuan)理(li)如下（二(er)抗(kang)用HRP標(biao)記）：反應底(di)物(wu)為(wei)過(guo)氧(yang)化物+魯(lu)米諾(nuo)，如遇到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可使(shi)膠(jiao)片曝(pu)光(guang)，就可(ke)洗(xi)出(chu)條帶(dai)。

70 鼠(shu)抗(kang)人(ren)血(xue)清(qing)素(su)單克隆抗(kang)體 Serotinin
鼠(shu)抗(kang)人(ren)omerase（Catalytic Unit）單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 omerase（Catalytic Unit）
LOP485 鼠(shu)抗(kang)人(ren)肌(ji)腱(jian)蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Tenascin（TN）
LOP486 兔抗(kang)人(ren)末端脫(tuo)氧(yang)核(he)苷(gan)酸轉移(yi)酶多克(ke)隆抗(kang)體 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
LOP487 鼠(shu)抗(kang)人(ren)末端脫(tuo)氧(yang)核(he)苷(gan)酸轉移(yi)酶單克隆抗(kang)體 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
LOP488 鼠(shu)抗(kang)人(ren)血(xue)小板(ban)反應蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Thrombospondin（TSP）
LOP489 鼠(shu)抗(kang)人(ren)胸(xiong)苷(gan)磷(lin)酸化酶單克隆抗(kang)體 Thymidine phosphorylase
LOP490 鼠(shu)抗(kang)人(ren)胸(xiong)苷(gan)酸合成酶記單克(ke)隆抗(kang)體 Thymidylate Synthase/5-Fu Resistance Marker
LOP49 鼠(shu)抗(kang)人(ren)甲(jia)狀腺(xian)球(qiu)蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Thyroglobulin（Tg）
LOP492 鼠(shu)兔抗(kang)人(ren)甲(jia)狀腺(xian)球(qiu)蛋(dan)白多克(ke)隆抗(kang)體 Thyroglobulin（Tg）
LOP493 鼠(shu)抗(kang)人(ren)甲(jia)狀腺(xian)蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Thyroglobulin（Tg）
LOP494 兔抗(kang)人(ren)甲(jia)狀腺(xian)蛋(dan)白多克(ke)隆抗(kang)體 Thyroglobulin（Tg）
LOP483 鼠(shu)抗(kang)人(ren)Tau蛋(dan)白單(dan)克(ke)隆抗(kang)體 Tau Protein 三(san)、 主(zhu)要試(shi)劑

、 丙烯酰(xian)胺和N，N’-亞甲(jia)雙丙烯酰(xian)胺，應以溫熱(re)（以(yi)利(li)於溶解雙丙稀(xi)酰(xian)胺）的去(qu)離(li)子水(shui)配制(zhi)含有29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙烯酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液(ye)丙稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞甲(jia)叉雙丙稀(xi)酰(xian)胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲(chu)於棕色瓶，4℃避(bi)光(guang)保存(cun)。嚴(yan)格核(he)實PH不(bu)得超過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發(fa)生(sheng)脫氨(an)基反應是(shi)光(guang)催化或堿催(cui)化的。使用(yong)期(qi)不(bu)得超過(guo)兩(liang)個(ge)月，隔幾(ji)個(ge)月須重(zhong)新(xin)配制(zhi)。如有沈(chen)澱，可(ke)以過(guo)濾。 Lung Cancer Resistance Protein （LRP）  、 十(shi)二(er)烷(wan)基硫(liu)#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配制(zhi)，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃縮膠緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾後40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩種緩沖(chong)液(ye)必(bi)須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備，再用HCL調(tiao)節PH值，而不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四(si)甲(jia)基乙(yi)二(er)胺催化過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成自由基而加(jia)速兩種丙稀(xi)酰(xian)胺的聚合(he)。PH太(tai)低(di)時，聚合(he)反應受到抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶液(ye)。提供兩種丙稀(xi)酰(xian)胺聚合所必(bi)須(xu)的自由基。去(qu)離(li)子水(shui)配制(zhi)數ml，臨用前(qian)配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備(bei)用。按(an):或:2比(bi)例與(yu)蛋(dan)白質樣(yang)品(pin)混(hun)合，在(zai)沸水(shui)終煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後再上樣(yang)，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電(dian)極(ji)緩沖(chong)液(ye)。臨用前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移緩沖(chong)液(ye)：配制(zhi)L轉(zhuan)移緩沖(chong)液(ye)，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲(jia)醇，加水(shui)至總量L。

9、 麗春紅(hong)染液(ye)儲(chu)存(cun)液(ye)：麗春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至00ml 用(yong)時上述儲(chu)存(cun)液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即(ji)成麗春紅(hong)S使(shi)用液(ye)。使用(yong)後應予(yu)以(yi)廢(fei)棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有(you)毒(du)，戴手套(tao)操(cao)作），溶於磷(lin)#緩沖(chong)鹽溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化物酶標記的第二(er)抗(kang)體。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。