【概(gai)要(yao)描(miao)述】雞骨(gu)骼(ge)肌細胞(bao)的(de)相(xiang)關產品：PGBE1人(ren)肺(fei)巨細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)腎微(wei)血(xue)管周細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)造(zao)血(xue)幹細胞(bao)小鼠原(yuan)代(dai)腸間(jian)質細(xi)胞(bao)兔(tu)原(yuan)代(dai)鞏(gong)膜上(shang)皮細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)食管上皮細胞(bao)兔(tu)原(yuan)代(dai)子宮(gong)內膜上皮細胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)肺腺癌成纖(xian)維(wei)細胞(bao)兔(tu)原(yuan)代(dai)尾尖成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)附睪(gao)管上皮細胞(bao)

雞骨(gu)骼(ge)肌細胞(bao)

包被(bei)條(tiao)件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻(pin)率(lv) 每(mei)2-3天換(huan)液(ye)壹次(ci)

生(sheng)長(chang)特(te)性 貼壁

細胞(bao)形態 成纖(xian)維(wei)細胞(bao)樣(yang)

傳代(dai)特(te)性 可傳2-3代(dai)

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶(mei)

培養(yang)條(tiao)件 氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

‍

雞骨(gu)骼(ge)肌分離(li)自(zi)四肢肌肉組織；骨(gu)骼(ge)肌又稱(cheng)橫紋肌，肌肉中的壹種，約(yue)占(zhan)全身重(zhong)量的40%。骨(gu)骼(ge)肌纖(xian)維(wei)為長(chang)柱形的多(duo)核(he)細胞(bao)，肌膜的(de)外面有基膜(mo)緊密(mi)貼(tie)附。屬(shu)於橫紋肌，橫紋肌還包括心肌與(yu)內臟(zang)橫紋肌，其中骨(gu)骼(ge)肌主要(yao)分布(bu)於四肢。每(mei)塊肌肉都是(shi)具有壹定形態、結(jie)構和(he)功(gong)能的器官，有豐富(fu)的(de)血管、淋(lin)巴(ba)分布(bu)，在軀(qu)體神經支(zhi)配下收縮或(huo)舒張，進行(xing)隨(sui)意(yi)運動。肌肉可根據(ju)共形狀、大小、位置、起止(zhi)點(dian)、纖(xian)維(wei)方向和(he)作用(yong)等命名(ming)。依(yi)形態命(ming)名(ming)的(de)如斜方(fang)肌、菱形肌、三角肌、梨狀(zhuang)肌等。骨(gu)骼(ge)肌細胞(bao)呈纖(xian)維(wei)狀，不分支(zhi)，有明顯(xian)橫紋，核(he)很多，且都(dou)位(wei)於細胞(bao)膜(mo)下方。肌細胞(bao)內有許(xu)多(duo)沿細胞(bao)長(chang)軸(zhou)平(ping)行(xing)排列的(de)細絲狀(zhuang)肌原(yuan)纖(xian)維(wei)。每(mei)壹肌原(yuan)纖(xian)維(wei)都有相(xiang)間(jian)排列的(de)明帶（Ⅰ帶）及(ji)暗(an)帶（A帶）。明帶染色較(jiao)淺(qian)，而(er)暗(an)帶染色較(jiao)深。暗帶中間(jian)有壹條較(jiao)明(ming)亮的(de)線稱H線。H線的中部(bu)有壹M線。明帶中間(jian)，有壹條較(jiao)暗(an)的線稱為Z線。兩個(ge)Z線之間(jian)的區(qu)段，叫(jiao)做壹個肌節。骨(gu)骼(ge)肌細胞(bao)也(ye)稱(cheng)橫紋肌細胞(bao)，細(xi)胞(bao)呈纖(xian)維(wei)狀，不分支(zhi)，有明顯(xian)橫紋，核(he)很多，且都(dou)位(wei)於細胞(bao)膜(mo)下方，細胞(bao)多(duo)呈梭行(xing)，具有壹定的方向性(xing)。骨(gu)骼(ge)肌細胞(bao)原(yuan)代(dai)分離(li)培養(yang)3天(tian)後，可見細胞(bao)貼(tie)壁(bi)伸(shen)展(zhan)，細胞(bao)形態大小不壹，呈梭形、不規(gui)則(ze)形、三角形或扇(shan)形，核(he)卵圓形、居(ju)中；2周後細胞(bao)匯(hui)合(he)，多數細(xi)胞(bao)伸(shen)展(zhan)呈長(chang)梭形，胞(bao)漿(jiang)豐富(fu)，有分枝(zhi)狀(zhuang)突起，細胞(bao)平(ping)行(xing)排列成(cheng)單層(ceng)或(huo)部(bu)分區(qu)域多(duo)層(ceng)重(zhong)疊(die)生(sheng)長(chang)，高低(di)起伏；細胞(bao)密(mi)度(du)低(di)時(shi)，常交(jiao)織(zhi)成(cheng)網狀(zhuang)；密度高時(shi)，則(ze)排列為旋渦狀(zhuang)或(huo)柵欄狀(zhuang)。傳(chuan)代(dai)後細胞(bao)生(sheng)長(chang)較(jiao)快，4-6天(tian)即(ji)可匯(hui)合(he)，並保(bao)持上述(shu)形態學特(te)征(zheng)和(he)生(sheng)長(chang)特(te)點(dian)。
方法簡(jian)介(jie)：

公司實(shi)驗室分離(li)的(de)雞骨(gu)骼(ge)肌采用(yong)混合(he)膠原(yuan)酶(mei)消化(hua)法結(jie)合(he)差速貼(tie)壁(bi)法制備而來(lai)，細胞(bao)總量約(yue)為5×10?cells/瓶(ping)。
質量檢(jian)測：

公司實(shi)驗室分離(li)的(de)雞骨(gu)骼(ge)肌經α-Sarcometric actin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和(he)真菌(jun)等。

壹、細胞(bao)培養(yang)

1取(qu)材 在無(wu)菌(jun)環(huan)境(jing)下從機(ji)體取(qu)出某(mou)種(zhong)組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗目(mu)的而(er)定），經過壹定的處(chu)理(li)（如消化(hua)分散(san)細胞(bao)、分離(li)等(deng)）後接入(ru)培養(yang)器血(xue)中，這(zhe)壹過程稱為取(qu)材。如是(shi)細胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大培養(yang)則(ze)無(wu)取(qu)材這(zhe)壹過程。機(ji)體取(qu)出的(de)組(zu)織細(xi)胞(bao)的(de)培養(yang)稱(cheng)為原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取(qu)得的(de)組(zu)織細(xi)胞(bao)接入(ru)培養(yang)瓶(ping)或培養(yang)板中的過程稱為培養(yang)。3凍存及(ji)復蘇(su)（可參閱(yue)後面有關章(zhang)節(jie)）為了保存細胞(bao)，特(te)別是(shi)不易獲得的突變(bian)型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存。凍存的溫(wen)度(du)壹般用(yong)液(ye)氮的溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集至凍存管中加(jia)入(ru)含(han)保護(hu)劑(ji)（壹般為二(er)甲(jia)亞(ya)碸(feng)或甘油）的(de)培養(yang)基(ji)，以壹定的冷卻(que)速度(du)凍存，最終(zhong)保(bao)存於液(ye)氮中。在極(ji)低(di)的溫(wen)度(du)下，細胞(bao)保(bao)存的時(shi)間(jian)幾乎是(shi)無限(xian)的。復蘇(su)壹般采用(yong)快融(rong)方法，即(ji)從液(ye)氮中取(qu)出凍存管後，立(li)即(ji)放入(ru)37℃水中，使(shi)之在壹分鐘內迅速融解。然後將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培養(yang)器皿(min)中進行(xing)培養(yang)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細胞(bao)分離(li)

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於胚胎(tai)、組(zu)織(zhi)器官及(ji)外(wai)周血，經特(te)殊分離(li)方(fang)法制備而來(lai)的原(yuan)初培養(yang)的(de)細胞(bao)稱(cheng)之為原(yuan)代(dai)細胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)的(de)分離(li)方(fang)法組(zu)織材(cai)料若(ruo)來(lai)自(zi)血(xue)液(ye)、羊(yang)水、胸(xiong)水或(huo)腹(fu)水的(de)懸(xuan)液(ye)材(cai)料，的(de)方法是(shi)采用(yong)1000r/min的低速(su)離(li)心10分鐘。經離(li)心後由於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比(bi)重(zhong)不同可在分層(ceng)液(ye)中形成不同層(ceng)，這(zhe)樣可根據(ju)需要(yao)收獲(huo)目的細胞(bao)。2實(shi)體組織材料的(de)分離(li)方(fang)法對(dui)於實(shi)體組織材料，由於細胞(bao)間(jian)結(jie)合(he)緊密(mi)，為了使(shi)組(zu)織(zhi)中的細胞(bao)充(chong)分分散(san)，形成細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可采用(yong)機(ji)械分散(san)法（物(wu)理(li)裂解）和(he)消化(hua)分離(li)法。

三、細胞(bao)增殖(zhi)檢(jian)測技術(shu)

目前主(zhu)要(yao)有兩種(zhong)用(yong)於檢(jian)測細胞(bao)增殖(zhi)能力(li)的(de)方法。壹種是(shi)直接的方法，通過直接測定進行(xing)分裂

的細胞(bao)數來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能力(li)。另(ling)壹種是(shi)間(jian)接的方法，即(ji)細胞(bao)活力(li)（cell viability）檢(jian)測方法，通過檢(jian)測樣品中健(jian)康(kang)細胞(bao)的(de)數目(mu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能力(li)。顯(xian)然(ran)，細(xi)胞(bao)活力(li)檢(jian)測法並不能(neng)最終證(zheng)明檢(jian)測樣品中的細胞(bao)是(shi)否在增殖(zhi)。如細胞(bao)在某(mou)壹培養(yang)條(tiao)件下會(hui)自(zi)發(fa)啟(qi)動(dong)雕亡程序，但(dan)藥(yao)物的(de)幹擾可抑制雕(diao)亡的(de)發生(sheng)；這(zhe)時(shi)若(ruo)采(cai)用(yong)細胞(bao)活力(li)檢(jian)測法，顯(xian)然(ran)可以區(qu)分兩種條(tiao)件下的細胞(bao)數量，但我(wo)們並不能(neng)從藥(yao)物幹擾組細胞(bao)數大於對(dui)照組(zu)的(de)事(shi)實(shi)說明藥物可促進細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的結(jie)論。所(suo)以最直接的證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用(yong)方法壹。

取(qu)材：首(shou)先(xian)，用(yong)培養(yang)液(ye)濕潤(run)所(suo)取(qu)的組(zu)織(zhi)材料，並用(yong)鋒(feng)利(li)的眼(yan)科剪(jian)去(qu)除附在其(qi)上(shang)的(de)脂肪和(he)結(jie)締組(zu)織。接著用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如PBS或Hanks液(ye)）漂洗，再(zai)用(yong)眼科彎(wan)剪(jian)將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪成小塊。多次(ci)用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂洗，直到液(ye)體清亮、無油滴為止。

接種：用(yong)濕潤(run)的(de)吸(xi)管吸(xi)取(qu)切碎(sui)的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到培養(yang)瓶(ping)皿中，並按(an)壹定間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放(fang)在培養(yang)瓶(ping)底壁上(shang)。註(zhu)意(yi)不要(yao)過多(duo)，確保組(zu)織塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在培養(yang)瓶(ping)底壁上(shang)。

培養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶(ping)翻轉，使(shi)瓶(ping)底朝上(shang)，在種(zhong)植(zhi)了組織(zhi)塊壹側的對(dui)側面加(jia)足(zu)培養(yang)液(ye)，避(bi)免組織塊(kuai)與(yu)培養(yang)液(ye)接觸，然後塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組織(zhi)塊的(de)壹側朝上，靜置於37℃培養(yang)箱中。待組織塊貼(tie)壁(bi)1到(dao)3小時(shi)後翻瓶(ping)，使(shi)貼(tie)壁(bi)的(de)組(zu)織塊浸沒(mei)在培養(yang)液(ye)中，繼(ji)續靜(jing)置(zhi)。換(huan)液(ye)：每(mei)隔2到(dao)3天(tian)更換(huan)壹次(ci)培養(yang)液(ye)，或(huo)者(zhe)根據(ju)培養(yang)瓶(ping)種顏(yan)色的變(bian)化(hua)確定換(huan)液(ye)時(shi)間(jian)。

壹、原(yuan)代(dai)細胞(bao)計(ji)數

將(jiang)血(xue)球計(ji)數板及(ji)蓋(gai)片用(yong)擦(ca)試幹凈，並將(jiang)蓋(gai)片蓋在計(ji)數板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許(xu)，滴加(jia)在蓋(gai)片邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液(ye)充(chong)滿蓋(gai)片和(he)計(ji)數板之間(jian)。

靜置3分鐘。

鏡(jing)下觀察(cha)，計(ji)算計(ji)數板四(si)大格細(xi)胞(bao)總數，壓(ya)線細胞(bao)只計(ji)左側和(he)上方(fang)的(de)。然(ran)後按下式計(ji)算：

細胞(bao)數/ml＝4大格細(xi)胞(bao)總數/ 4×10000

註意(yi)：鏡(jing)下偶見由兩個以上細胞(bao)組(zu)成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算，若(ruo)細(xi)胞(bao)團占(zhan)10%以上，說明分散(san)不好(hao)，需重(zhong)新(xin)制備細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細胞(bao)活力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以0.5ml加(jia)入(ru)試管中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染液(ye)，染色2壹3分鐘。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗(tu)於載玻片上，加(jia)上(shang)蓋片。

鏡(jing)下取(qu)幾個任(ren)意(yi)視野分別計(ji)死細(xi)胞(bao)和(he)活細胞(bao)數，計(ji)細胞(bao)活力(li)。

死細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺盼蘭染上色，鏡(jing)下可見深蘭色(se)的細(xi)胞(bao)，活細胞(bao)不被(bei)染色，鏡(jing)下呈無色(se)透明(ming)狀(zhuang)。

活力(li)測定可以和(he)細胞(bao)計(ji)數合(he)起來(lai)進(jin)行(xing)，但要(yao)考慮到(dao)染液(ye)對(dui)原(yuan)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀(xi)釋作用(yong)。