【概要(yao)描述(shu)】雞(ji)胚(pei)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關(guan)產品：NCI-H1299-luc-EGFP人(ren)非(fei)小(xiao)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原代牙(ya)齦(yin)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)兔(tu)原代肺(fei)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原代肌(ji)腱細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原代結腸(chang)粘(zhan)膜上皮(pi)細(xi)胞(bao)羊原代皮(pi)膚(fu)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)人(ren)原代毛囊(nang)幹(gan)細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代腎(shen)動(dong)脈內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)兔(tu)原代子(zi)宮(gong)內膜間質細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代下丘腦神(shen)經(jing)元細(xi)胞(bao)

雞(ji)胚(pei)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含(han)FBS、生(sheng)長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液頻率 每(mei)2-3天(tian)換液壹次

生(sheng)長特(te)性 貼(tie)壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代特(te)性 可傳5代左(zuo)右(you)；3代以(yi)內(nei)狀(zhuang)態(tai)

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶

培(pei)養(yang)條件(jian) 氣(qi)相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

雞(ji)胚(pei)成(cheng)纖(xian)維(wei)分(fen)離(li)自胚(pei)胎(tai)；成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)（Fibroblast）是(shi)疏松(song)結締(di)組織(zhi)的(de)主要(yao)細(xi)胞(bao)成(cheng)分(fen)，由胚(pei)胎(tai)時期的(de)間(jian)充質細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)而(er)來。成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)較(jiao)大(da)，輪廓清楚(chu)，多(duo)為突起(qi)的(de)紡(fang)錘形(xing)或(huo)星(xing)形(xing)的(de)扁(bian)平(ping)狀(zhuang)結構，其(qi)細(xi)胞(bao)核呈(cheng)規(gui)則(ze)的(de)卵圓(yuan)形(xing)，核仁(ren)大(da)而(er)明顯(xian)。成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)功能(neng)活(huo)動旺盛(sheng)，細(xi)胞(bao)質嗜(shi)弱(ruo)堿(jian)性(xing)，具(ju)明(ming)顯(xian)的(de)蛋白(bai)質合成(cheng)和(he)分泌活(huo)動，在(zai)壹定條件(jian)下，它可以實(shi)現(xian)跟(gen)纖維(wei)細(xi)胞(bao)的(de)互(hu)相(xiang)轉化；成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)對不同(tong)程(cheng)度的細(xi)胞(bao)變(bian)性(xing)、壞(huai)死和(he)組織(zhi)缺(que)損的(de)修(xiu)復有(you)著十分重(zhong)要(yao)的(de)作(zuo)用(yong)。剛(gang)分離(li)的(de)胚(pei)胎(tai)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)呈(cheng)圓(yuan)形(xing)、折(zhe)光(guang)性(xing)良好，懸(xuan)浮(fu)於(yu)培(pei)養(yang)基中(zhong)。30min細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)，其(qi)中(zhong)部(bu)分開(kai)始(shi)伸(shen)出偽足(zu)，表(biao)現為小(xiao)的突(tu)起(qi)；6h後(hou)細(xi)胞(bao)基(ji)本(ben)貼(tie)壁wan全，伸展成(cheng)梭形(xing)，胞(bao)核清晰(xi)，分布(bu)較(jiao)均勻，散(san)在(zai)生(sheng)長，不(bu)聚(ju)集(ji)成(cheng)團；細(xi)胞(bao)生(sheng)長迅速(su)，5-7天(tian)即(ji)呈(cheng)融(rong)合(he)狀(zhuang)態(tai)，細(xi)胞(bao)排(pai)列(lie)緊(jin)密，有的(de)交叉(cha)重(zhong)疊生(sheng)長，平(ping)坦(tan)、胞(bao)體較(jiao)大(da)，細(xi)胞(bao)質透(tou)明，細(xi)胞(bao)核較(jiao)大(da)，呈(cheng)橢(tuo)圓(yuan)形(xing)，顏(yan)色(se)淡。細(xi)胞(bao)融(rong)合(he)，並彼此(ci)連(lian)接成(cheng)網(wang)狀(zhuang)；細(xi)胞(bao)呈(cheng)突(tu)起(qi)的(de)紡(fang)錘形(xing)或(huo)星(xing)形(xing)的(de)扁(bian)平(ping)分(fen)布(bu)。細(xi)胞(bao)呈(cheng)突(tu)起(qi)的(de)紡(fang)錘形(xing)或(huo)星(xing)形(xing)的(de)扁(bian)平(ping)分(fen)布(bu)。該細(xi)胞(bao)常(chang)用(yong)作ES細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)常用(yong)的飼(si)養(yang)層(ceng)細(xi)胞(bao)，能(neng)產生(sheng)抑(yi)制ES細(xi)胞(bao)自主分化和(he)促進ES細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的(de)因(yin)子(zi)，故能(neng)有效(xiao)地(di)促進ES細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)並維(wei)持其未分化(hua)特(te)性和(he)多(duo)潛能(neng)性，且分泌效(xiao)果(guo)優於(yu)外(wai)源(yuan)添(tian)加(jia)的(de)壹些(xie)因子，而(er)且可以為ES細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)提(ti)供類(lei)似(si)於(yu)體(ti)內(nei)的(de)微(wei)環境，故在(zai)研究(jiu)哺乳動物ES細(xi)胞(bao)中(zhong)得到(dao)廣(guang)泛使用(yong)。
方法簡(jian)介：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離(li)的(de)雞(ji)胚(pei)成(cheng)纖(xian)維(wei)采(cai)用(yong)yi蛋白(bai)酶消化(hua)法結合(he)差(cha)速(su)貼(tie)壁(bi)法制備而(er)來，細(xi)胞(bao)總(zong)量(liang)約(yue)為5×10?cells/瓶(ping)。
質量(liang)檢(jian)測(ce)：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離(li)的(de)雞(ji)胚(pei)成(cheng)纖(xian)維(wei)經(jing)Vimentin免(mian)疫熒(ying)光(guang)鑒(jian)定(ding)，純(chun)度可達(da)90%以上(shang)，且不含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母和(he)真菌(jun)等(deng)。

壹、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材 在(zai)無菌(jun)環境下從機(ji)體取(qu)出某種組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目的而(er)定），經(jing)過壹定的(de)處(chu)理（如(ru)消(xiao)化(hua)分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接入培(pei)養(yang)器血(xue)中(zhong)，這壹過程稱(cheng)為取材。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大(da)培養(yang)則(ze)無(wu)取(qu)材這壹過程。機(ji)體(ti)取出的組織(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)稱(cheng)為原代培(pei)養(yang)。2培養(yang) 將取(qu)得的組織(zhi)細(xi)胞(bao)接入培(pei)養(yang)瓶(ping)或培(pei)養(yang)板中(zhong)的過程稱(cheng)為培養(yang)。3凍存(cun)及復蘇(su)（可參閱後(hou)面(mian)有(you)關章節(jie)）為了保存(cun)細(xi)胞(bao)，特(te)別是不(bu)易獲(huo)得的(de)突變(bian)型(xing)細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的(de)溫(wen)度壹般用(yong)液氮(dan)的(de)溫(wen)度－196℃，將細(xi)胞(bao)收(shou)集(ji)至(zhi)凍存(cun)管中(zhong)加(jia)入(ru)含保護劑(ji)（壹般為二(er)甲(jia)亞(ya)碸(feng)或甘(gan)油）的(de)培(pei)養(yang)基，以(yi)壹定的(de)冷(leng)卻(que)速(su)度凍存(cun)，最(zui)終保(bao)存(cun)於(yu)液(ye)氮(dan)中(zhong)。在(zai)極低(di)的溫(wen)度下，細(xi)胞(bao)保(bao)存(cun)的(de)時間幾乎是(shi)無(wu)限(xian)的(de)。復蘇(su)壹般采(cai)用(yong)快融(rong)方法，即(ji)從(cong)液氮(dan)中(zhong)取出凍存(cun)管後(hou)，立即(ji)放(fang)入37℃水中(zhong)，使之(zhi)在(zai)壹分鐘內迅速(su)融(rong)解(jie)。然後(hou)將細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培(pei)養(yang)器皿中(zhong)進行培養(yang)。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器官(guan)及外周血(xue)，經(jing)特(te)殊分離(li)方法制備而(er)來的(de)原初(chu)培養(yang)的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為原代細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離(li)方法組織(zhi)材料若來(lai)自血(xue)液(ye)、羊水、胸(xiong)水或(huo)腹(fu)水的(de)懸液(ye)材料，的(de)方法是采(cai)用(yong)1000r/min的低(di)速(su)離(li)心(xin)10分鐘。經離(li)心(xin)後(hou)由於(yu)各(ge)種細(xi)胞(bao)的(de)比(bi)重(zhong)不同(tong)可在(zai)分層(ceng)液中(zhong)形(xing)成(cheng)不(bu)同層(ceng)，這樣可根(gen)據需要(yao)收(shou)獲(huo)目的(de)細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組織(zhi)材料的(de)分離(li)方法對於(yu)實(shi)體(ti)組織(zhi)材料，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間(jian)結合(he)緊(jin)密，為了使組織(zhi)中(zhong)的細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散，形(xing)成(cheng)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用(yong)機械分散法（物理裂(lie)解）和(he)消化(hua)分離(li)法。

三(san)、細(xi)胞(bao)增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技術

目(mu)前主要(yao)有(you)兩(liang)種(zhong)用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)能(neng)力(li)的方法。壹種是(shi)直接的方法，通過直接測(ce)定(ding)進行分裂(lie)

的(de)細(xi)胞(bao)數來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。另壹種是(shi)間接的方法，即(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測(ce)方法，通過檢(jian)測(ce)樣(yang)品中(zhong)健康(kang)細(xi)胞(bao)的(de)數目(mu)來(lai)評價細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測(ce)法並不能(neng)最(zui)終證明檢(jian)測(ce)樣(yang)品中(zhong)的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在(zai)增殖(zhi)。如(ru)細(xi)胞(bao)在(zai)某壹培養(yang)條件(jian)下會(hui)自發啟(qi)動(dong)雕(diao)亡程(cheng)序(xu)，但(dan)藥(yao)物(wu)的(de)幹(gan)擾可抑(yi)制雕亡的(de)發生(sheng)；這時若采(cai)用(yong)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測(ce)法，顯(xian)然可以區(qu)分兩(liang)種條件(jian)下的細(xi)胞(bao)數量(liang)，但(dan)我們(men)並不能(neng)從藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組細(xi)胞(bao)數大(da)於(yu)對照(zhao)組的(de)事實(shi)說(shuo)明藥(yao)物(wu)可促進細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的(de)結論。所以最(zui)直(zhi)接的證據應(ying)該采(cai)用(yong)方法壹。

取(qu)材：首先(xian)，用(yong)培養(yang)液濕(shi)潤所取的組織(zhi)材料，並用(yong)鋒利(li)的眼(yan)科剪去除(chu)附(fu)在(zai)其上(shang)的(de)脂肪(fang)和(he)結締(di)組織(zhi)。接著用(yong)平(ping)衡(heng)液（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂洗，再(zai)用(yong)眼科彎剪將(jiang)組織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次(ci)用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂洗，直(zhi)到(dao)液(ye)體清亮(liang)、無油滴為止。

接種：用(yong)濕(shi)潤的吸(xi)管吸(xi)取切(qie)碎(sui)的組織(zhi)塊(kuai)，輕輕吹到(dao)培(pei)養(yang)瓶(ping)皿中(zhong)，並按(an)壹定間(jian)距均勻放(fang)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。註意(yi)不要(yao)過多(duo)，確(que)保組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將培(pei)養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)，使瓶(ping)底(di)朝上(shang)，在(zai)種植了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹側的(de)對側面(mian)加(jia)足(zu)培養(yang)液，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液接觸，然後(hou)塞緊(jin)瓶(ping)塞。將(jiang)種植了(le)組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹側朝(chao)上，靜置於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱中(zhong)。待(dai)組織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使貼(tie)壁的組織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在(zai)培養(yang)液中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜置。換液：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天(tian)更換壹次培(pei)養(yang)液，或(huo)者根(gen)據培(pei)養(yang)瓶(ping)種顏(yan)色(se)的變化確(que)定(ding)換液時間。

壹、原代細(xi)胞(bao)計(ji)數

將(jiang)血(xue)球(qiu)計(ji)數板(ban)及蓋片(pian)用(yong)擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並將蓋片(pian)蓋在(zai)計數板(ban)上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出少許，滴(di)加(jia)在(zai)蓋片(pian)邊緣(yuan)，使懸(xuan)液充滿蓋片(pian)和(he)計數板(ban)之(zhi)間。

靜置3分鐘。

鏡(jing)下觀(guan)察，計(ji)算計(ji)數板(ban)四大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數，壓(ya)線細(xi)胞(bao)只(zhi)計(ji)左(zuo)側和(he)上方的(de)。然後(hou)按(an)下式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下偶見由兩個(ge)以(yi)上細(xi)胞(bao)組成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算(suan)，若細(xi)胞(bao)團占(zhan)10%以上(shang)，說明分散不好，需重(zhong)新制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試(shi)管中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染(ran)液，染(ran)色2壹3分鐘。

吸(xi)取少許懸(xuan)液(ye)塗於(yu)載(zai)玻(bo)片上(shang)，加(jia)上(shang)蓋片(pian)。

鏡(jing)下取幾個(ge)任(ren)意(yi)視野分別(bie)計(ji)死細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細(xi)胞(bao)數，計(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺盼(pan)蘭染(ran)上色(se)，鏡(jing)下可見深蘭色的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色，鏡(jing)下呈(cheng)無(wu)色(se)透(tou)明狀(zhuang)。

活(huo)力(li)測(ce)定(ding)可以和(he)細(xi)胞(bao)計(ji)數合(he)起(qi)來(lai)進行，但(dan)要(yao)考(kao)慮(lv)到(dao)染(ran)液對原細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀釋(shi)作(zuo)用(yong)。