【概要(yao)描述】雞前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)的相(xiang)關(guan)產(chan)品：A549/GFP (STR)人(ren)肺癌(ai)細(xi)胞小鼠(shu)原代(dai)腎小球(qiu)內皮細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)CD3+T淋巴細(xi)胞(bao)小鼠(shu)原代(dai)室管膜(mo)細(xi)胞人(ren)原代(dai)膽囊(nang)平滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)小鼠(shu)原代(dai)Ⅱ型肺泡(pao)上(shang)皮細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代(dai)韌(ren)帶(dai)成(cheng)纖(xian)維細胞大(da)鼠(shu)原代(dai)腸神經膠(jiao)質(zhi)細胞大(da)鼠(shu)原代(dai)膽囊(nang)上(shang)皮細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)胃癌相(xiang)關(guan)成(cheng)纖(xian)維細胞

雞(ji)前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)

培(pei)養基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天(tian)換液壹次

生(sheng)長特性(xing) 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞形態 成(cheng)纖(xian)維細胞樣

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可(ke)傳5代(dai)左右；3代(dai)以內(nei)狀(zhuang)態(tai)

消(xiao)化液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶

培(pei)養條(tiao)件(jian) 氣相(xiang)：空氣，95%；CO2，5%

雞(ji)前(qian)脂肪(fang)分離(li)自(zi)脂(zhi)肪組織；脂肪組織主(zhu)要(yao)由大(da)量(liang)群集(ji)的脂(zhi)肪(fang)細胞(bao)構成(cheng)，聚(ju)集(ji)成(cheng)團(tuan)的脂(zhi)肪細(xi)胞由薄層(ceng)疏(shu)松(song)結締組織分隔成(cheng)小葉(ye)；貯(zhu)存(cun)的脂肪(fang)，在需(xu)要(yao)時可迅(xun)速(su)分(fen)解(jie)成(cheng)甘(gan)油和脂肪(fang)酸(suan)，經(jing)血(xue)液(ye)輸送到各(ge)組織以供(gong)利(li)用(yong)。它們影(ying)響胰島(dao)素(su)敏(min)感(gan)性(xing)、血壓水(shui)平、內(nei)皮功(gong)能、纖(xian)溶活動及炎(yan)癥反(fan)應(ying)，參與(yu)多(duo)種重(zhong)要(yao)病(bing)理生理過(guo)程(cheng)；脂(zhi)肪組(zu)織已由過(guo)去(qu)單純(chun)作為(wei)能量(liang)儲存的(de)器官(guan)而成(cheng)為(wei)壹(yi)個(ge)極(ji)其重(zhong)要(yao)的內(nei)分泌(mi)系統(tong)。脂(zhi)肪組織在體內(nei)含(han)有(you)兩(liang)種主(zhu)要(yao)的細(xi)胞：壹(yi)種是在胞(bao)漿(jiang)內積(ji)聚(ju)脂滴的(de)成(cheng)熟(shu)脂肪(fang)細胞；另壹種是雖未在(zai)胞漿(jiang)內積(ji)聚(ju)脂滴但有(you)這種潛能的(de)前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)。前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)呈梭形，有(you)分裂(lie)和增殖的(de)能力(li)；成(cheng)熟(shu)的脂(zhi)肪細胞呈圓(yuan)形，已經失(shi)去了(le)分(fen)裂及增(zeng)殖的(de)能力(li)。由於前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)是壹類(lei)具有(you)增殖和向脂肪(fang)細胞(bao)分(fen)化(hua)能力(li)的特異化(hua)前(qian)體細(xi)胞，與(yu)肥(fei)胖(pang)有(you)著非常密(mi)切(qie)的關(guan)系(xi)。前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)是壹種類(lei)成(cheng)纖(xian)維細胞，在演變(bian)的過(guo)程(cheng)中(zhong)不(bu)斷吸(xi)收脂(zhi)質(zhi)，最終成(cheng)為(wei)成(cheng)熟(shu)的脂(zhi)肪細胞。前(qian)脂肪(fang)細胞(bao)對外界機械損傷(shang)的抵(di)抗(kang)力較(jiao)強，可(ke)望成(cheng)為(wei)軟(ruan)組(zu)織缺損的(de)有(you)益填(tian)充物。
方(fang)法(fa)簡(jian)介：

公(gong)司實驗室分(fen)離(li)的雞(ji)前(qian)脂肪(fang)采用(yong)膠原酶消化(hua)法(fa)制(zhi)備(bei)而來，細(xi)胞總(zong)量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢(jian)測(ce)：

公(gong)司實驗室分(fen)離(li)的雞(ji)前(qian)脂肪(fang)經油紅O染色檢(jian)測(ce)，純(chun)度可達90%以(yi)上，且(qie)不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xi)菌、酵(jiao)母和真菌等。

壹(yi)、細胞培(pei)養

1取(qu)材 在無菌(jun)環(huan)境下從機體取(qu)出(chu)某(mou)種組織細胞（視實(shi)驗(yan)目(mu)的而(er)定），經(jing)過(guo)壹(yi)定(ding)的(de)處(chu)理（如消化(hua)分(fen)散細(xi)胞、分離(li)等）後接(jie)入培(pei)養器(qi)血(xue)中(zhong)，這壹過(guo)程(cheng)稱為(wei)取(qu)材。如是細胞(bao)株的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養則(ze)無(wu)取(qu)材這壹過(guo)程(cheng)。機體取(qu)出(chu)的(de)組(zu)織細胞的培(pei)養稱為(wei)原代(dai)培(pei)養。2培(pei)養 將(jiang)取(qu)得(de)的(de)組(zu)織細胞接(jie)入培(pei)養瓶或(huo)培(pei)養板(ban)中(zhong)的(de)過(guo)程(cheng)稱為(wei)培(pei)養。3凍(dong)存(cun)及復(fu)蘇（可(ke)參閱後面(mian)有(you)關(guan)章節(jie)）為(wei)了(le)保(bao)存(cun)細(xi)胞(bao)，特別是不易(yi)獲得(de)的(de)突變型(xing)細胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將(jiang)細胞(bao)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的溫(wen)度壹般(ban)用(yong)液氮的(de)溫(wen)度－196℃，將(jiang)細胞(bao)收集(ji)至凍(dong)存(cun)管中(zhong)加(jia)入含(han)保(bao)護(hu)劑(ji)（壹般(ban)為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘(gan)油）的(de)培(pei)養基(ji)，以(yi)壹定的(de)冷卻(que)速(su)度凍(dong)存(cun)，最終保(bao)存(cun)於(yu)液(ye)氮中(zhong)。在(zai)極(ji)低(di)的溫度下，細(xi)胞保(bao)存(cun)的(de)時間幾乎是無限(xian)的。復(fu)蘇壹(yi)般(ban)采用(yong)快(kuai)融(rong)方法(fa)，即從液(ye)氮(dan)中(zhong)取(qu)出(chu)凍(dong)存(cun)管後，立(li)即(ji)放(fang)入37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之(zhi)在(zai)壹分鐘(zhong)內迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。然後將(jiang)細胞(bao)轉入培(pei)養器(qi)皿中(zhong)進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)分(fen)離(li)

凡是來源(yuan)於胚(pei)胎、組織器官(guan)及外(wai)周(zhou)血，經(jing)特殊分離(li)方法(fa)制(zhi)備(bei)而來的(de)原初(chu)培(pei)養的(de)細(xi)胞稱之為(wei)原代(dai)細胞(bao)。1懸浮細胞(bao)的分(fen)離方(fang)法(fa)組織材料若來自(zi)血(xue)液、羊水、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹(fu)水(shui)的(de)懸液材料，的方(fang)法(fa)是采用(yong)1000r/min的低速(su)離(li)心10分(fen)鐘(zhong)。經離(li)心後由(you)於(yu)各(ge)種細胞(bao)的比重(zhong)不同(tong)可在分層(ceng)液(ye)中(zhong)形(xing)成(cheng)不(bu)同層(ceng)，這樣可根據需要(yao)收獲目(mu)的(de)細胞。2實(shi)體組(zu)織材料的分(fen)離(li)方法(fa)對於實(shi)體組(zu)織材料，由於(yu)細(xi)胞間結合(he)緊(jin)密(mi)，為(wei)了(le)使(shi)組織中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)充分分(fen)散，形(xing)成(cheng)細(xi)胞懸液，可(ke)采用(yong)機械分(fen)散法(fa)（物理裂解(jie)）和消化(hua)分(fen)離(li)法(fa)。

三、細胞增殖檢(jian)測(ce)技(ji)術

目(mu)前(qian)主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種用(yong)於檢(jian)測(ce)細(xi)胞增殖能力(li)的方法(fa)。壹種是直接(jie)的(de)方法(fa)，通過(guo)直(zhi)接(jie)測(ce)定(ding)進(jin)行分(fen)裂(lie)

的(de)細胞數來(lai)評價細胞的(de)增(zeng)殖能力(li)。另壹種是間接(jie)的(de)方法(fa)，即細胞(bao)活力（cell viability）檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，通過(guo)檢(jian)測(ce)樣(yang)品中(zhong)健康細胞(bao)的(de)數(shu)目來(lai)評價細胞的(de)增(zeng)殖能力(li)。顯然，細(xi)胞活力檢(jian)測(ce)法(fa)並(bing)不能最(zui)終證明檢(jian)測(ce)樣(yang)品中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)是否在(zai)增殖。如細胞(bao)在(zai)某壹(yi)培(pei)養條(tiao)件(jian)下會(hui)自(zi)發(fa)啟動雕亡(wang)程(cheng)序(xu)，但藥(yao)物的(de)幹擾可抑制(zhi)雕(diao)亡(wang)的發(fa)生(sheng)；這時若采用(yong)細胞活力檢(jian)測(ce)法(fa)，顯然可(ke)以區分(fen)兩(liang)種條(tiao)件(jian)下的(de)細胞數量，但我們並(bing)不能從藥(yao)物幹擾組細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於(yu)對(dui)照組的事(shi)實(shi)說明藥(yao)物可(ke)促(cu)進(jin)細胞(bao)增(zeng)殖的(de)結論(lun)。所(suo)以最(zui)直接(jie)的(de)證據應該采用(yong)方法(fa)壹。

取(qu)材：首先(xian)，用(yong)培(pei)養液(ye)濕潤所取(qu)的(de)組(zu)織材料，並(bing)用(yong)鋒(feng)利(li)的(de)眼(yan)科剪(jian)去(qu)除(chu)附(fu)在(zai)其(qi)上(shang)的(de)脂肪和結締組織。接(jie)著(zhe)用(yong)平衡(heng)液（如PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗，再用(yong)眼(yan)科彎(wan)剪(jian)將(jiang)組織塊剪(jian)成(cheng)小塊。多(duo)次用(yong)PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗，直到液體清(qing)亮(liang)、無油滴為(wei)止(zhi)。

接(jie)種：用(yong)濕潤的吸(xi)管吸(xi)取(qu)切(qie)碎(sui)的(de)組(zu)織塊，輕(qing)輕(qing)吹到培(pei)養瓶皿中(zhong)，並(bing)按壹(yi)定(ding)間距(ju)均勻放(fang)在培(pei)養瓶底壁(bi)上。註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)過(guo)多(duo)，確保(bao)組(zu)織塊切面(mian)貼(tie)在(zai)培(pei)養瓶底壁(bi)上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶翻(fan)轉，使(shi)瓶底朝上(shang)，在種植了(le)組(zu)織塊壹側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加(jia)足(zu)培(pei)養液(ye)，避(bi)免組織塊與(yu)培(pei)養液(ye)接(jie)觸(chu)，然後塞(sai)緊(jin)瓶塞(sai)。將(jiang)種植了(le)組(zu)織塊的壹(yi)側朝(chao)上(shang)，靜置於(yu)37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組織塊貼(tie)壁(bi)1到3小時後翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁(bi)的組(zu)織塊浸沒(mei)在培(pei)養液(ye)中(zhong)，繼續(xu)靜(jing)置。換液：每隔2到(dao)3天(tian)更換壹次培(pei)養液(ye)，或(huo)者根據培(pei)養瓶種顏(yan)色的變(bian)化(hua)確定換液時間。

壹(yi)、原代(dai)細胞(bao)計(ji)數(shu)

將(jiang)血球(qiu)計(ji)數(shu)板(ban)及蓋(gai)片用(yong)擦(ca)試幹凈，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片蓋(gai)在(zai)計(ji)數(shu)板(ban)上(shang)。

將(jiang)細胞(bao)懸液吸(xi)出少(shao)許，滴加(jia)在(zai)蓋(gai)片邊緣(yuan)，使(shi)懸液充滿蓋(gai)片和計(ji)數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置3分(fen)鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察，計(ji)算計(ji)數(shu)板(ban)四大(da)格(ge)細胞總(zong)數(shu)，壓線細胞(bao)只(zhi)計(ji)左(zuo)側(ce)和上方(fang)的(de)。然(ran)後按(an)下式(shi)計(ji)算：

細(xi)胞數/ml＝4大(da)格(ge)細胞總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下偶(ou)見(jian)由(you)兩(liang)個(ge)以上(shang)細(xi)胞(bao)組成(cheng)的(de)細胞(bao)團(tuan)，應按(an)單個細胞計(ji)算，若細胞(bao)團(tuan)占10%以(yi)上，說明分散不(bu)好，需重(zhong)新(xin)制(zhi)備(bei)細胞懸液。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)活力

將(jiang)細胞(bao)懸液以(yi)0.5ml加(jia)入試管中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染液，染色2壹3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許懸液塗於載(zai)玻(bo)片上，加(jia)上(shang)蓋(gai)片。

鏡下取(qu)幾個任(ren)意(yi)視(shi)野(ye)分(fen)別(bie)計(ji)死細胞(bao)和活細胞(bao)數(shu)，計(ji)細(xi)胞(bao)活力。

死細胞(bao)能被(bei)臺盼蘭(lan)染上色，鏡下可(ke)見(jian)深蘭(lan)色的細(xi)胞(bao)，活細胞(bao)不(bu)被染色，鏡下呈(cheng)無色透明狀。

活力測(ce)定(ding)可以和細胞(bao)計(ji)數(shu)合(he)起(qi)來(lai)進(jin)行，但要(yao)考慮(lv)到染液對(dui)原細胞懸液的(de)加(jia)倍(bei)稀(xi)釋作用(yong)。