【概要描(miao)述】雞卵泡(pao)基膜(mo)細(xi)胞的相(xiang)關產(chan)品(pin)：U87 MG/LUC (STR)人(ren)惡性膠(jiao)質瘤(liu)細(xi)胞小鼠原(yuan)代(dai)股動(dong)脈(mai)平(ping)滑(hua)肌細(xi)胞大(da)鼠(shu)原(yuan)代(dai)前列腺(xian)基底細(xi)胞大(da)鼠(shu)原(yuan)代(dai)輸卵管(guan)上皮細(xi)胞雞輸卵管(guan)上皮細(xi)胞豬(zhu)原(yuan)代(dai)小腸黏膜(mo)上皮細(xi)胞大(da)鼠(shu)原(yuan)代(dai)晶狀(zhuang)體上皮細(xi)胞大(da)鼠(shu)原(yuan)代(dai)氣管(guan)平(ping)滑(hua)肌細(xi)胞人(ren)原(yuan)代(dai)冠狀動脈平(ping)滑(hua)肌細(xi)胞兔原(yuan)代(dai)骨髓(sui)基質(zhi)幹(gan)細(xi)胞

雞卵泡(pao)基膜(mo)細(xi)胞

培(pei)養(yang)基(ji) 含FBS、生(sheng)長(chang)添加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液頻率(lv) 每2-3天(tian)換液壹次

生(sheng)長(chang)特性 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞形(xing)態(tai) 成纖(xian)維(wei)細(xi)胞樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性 可傳(chuan)2-3代(dai)

消(xiao)化液 0.25%yi蛋(dan)白酶

培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian) 氣相(xiang)：空(kong)氣，95%；CO2，5%

雞卵泡(pao)基膜(mo)分(fen)離自雞卵泡(pao)組織；成(cheng)熟(shu)卵泡(pao)是卵巢(chao)的組織結(jie)構(gou)成(cheng)分之壹，卵泡(pao)腔(qiang)很(hen)大(da)，卵丘很(hen)明(ming)顯。卵泡(pao)內(nei)膜(mo)細(xi)胞緊靠(kao)卵泡(pao)顆粒(li)層，與顆粒(li)層細(xi)胞之(zhi)間有(you)壹層基膜(mo)相(xiang)隔，內(nei)膜(mo)細(xi)胞呈(cheng)多邊形(xing)，胞(bao)質清亮(liang)，胞核圓(yuan)形(xing)，細(xi)胞間可(ke)見(jian)許(xu)多毛(mao)細(xi)血管(guan)，外膜(mo)細(xi)胞位(wei)於(yu)最(zui)外層，多呈梭(suo)形(xing)，與周(zhou)圍(wei)結(jie)締組織分(fen)界(jie)不明(ming)顯。卵泡(pao)（follicle）中卵母(mu)細(xi)胞四(si)周(zhou)有(you)壹層菱形或扁平(ping)細(xi)胞圍(wei)繞(rao)，在卵泡(pao)開始(shi)發育(yu)、卵細(xi)胞成(cheng)長(chang)的同(tong)時，周(zhou)圍(wei)的菱形細(xi)胞變為立方(fang)形(xing)，並由單層(ceng)增生(sheng)成(cheng)復(fu)層，因(yin)其細(xi)胞漿(jiang)內(nei)含有顆(ke)粒(li)，故(gu)稱為顆粒(li)細(xi)胞。初(chu)級(ji)卵泡(pao)的顆粒(li)細(xi)胞為單層(ceng)；次(ci)級卵泡(pao)的顆粒(li)細(xi)胞增至復(fu)層；成(cheng)熟卵泡(pao)的顆粒(li)細(xi)胞展(zhan)開又(you)變為單層(ceng)。顆(ke)粒(li)細(xi)胞的胞核大而(er)圓(yuan)，著(zhe)色深，細(xi)胞的遊離面有許多細(xi)長(chang)突(tu)起伸(shen)入放(fang)射(she)帶(dai)的凹陷(xian)部(bu)。
方(fang)法(fa)簡(jian)介：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分離的雞卵泡(pao)基膜(mo)采用(yong)先機(ji)械分(fen)離後(hou)膠原(yuan)酶反復(fu)消(xiao)化法(fa)、並通(tong)過(guo)專(zhuan)用(yong)培(pei)養(yang)基(ji)培(pei)養(yang)篩(shai)選制(zhi)備而(er)來(lai)，細(xi)胞總(zong)量(liang)約(yue)為5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分離的雞卵泡(pao)基膜(mo)經(jing)3β-HSD免(mian)疫熒光鑒(jian)定(ding)，純(chun)度(du)可(ke)達(da)90%以(yi)上，且不(bu)含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細(xi)菌、酵(jiao)母(mu)和真菌(jun)等(deng)。

壹、細(xi)胞培(pei)養(yang)

1取材 在(zai)無菌環(huan)境(jing)下(xia)從(cong)機體(ti)取出某(mou)種組織細(xi)胞（視(shi)實(shi)驗目(mu)的而(er)定(ding)），經(jing)過(guo)壹定(ding)的處(chu)理（如(ru)消(xiao)化分散細(xi)胞、分(fen)離等(deng)）後(hou)接(jie)入培(pei)養(yang)器血中，這(zhe)壹過(guo)程稱為取材。如(ru)是細(xi)胞株(zhu)的擴(kuo)大培(pei)養(yang)則無(wu)取材這(zhe)壹過(guo)程。機(ji)體取出的組織細(xi)胞的培(pei)養(yang)稱為原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取得的組織細(xi)胞接(jie)入培(pei)養(yang)瓶(ping)或(huo)培(pei)養(yang)板(ban)中的過(guo)程稱為培(pei)養(yang)。3凍存(cun)及復(fu)蘇（可參閱(yue)後(hou)面有關章(zhang)節）為了(le)保存(cun)細(xi)胞，特(te)別是(shi)不易(yi)獲得的突(tu)變型細(xi)胞或(huo)細(xi)胞株(zhu)，要將(jiang)細(xi)胞凍存(cun)。凍存(cun)的溫(wen)度壹般(ban)用液氮的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞收(shou)集至凍存(cun)管(guan)中加入含保護(hu)劑(ji)（壹般(ban)為二甲亞碸(feng)或(huo)甘油）的培(pei)養(yang)基(ji)，以(yi)壹定(ding)的冷(leng)卻速(su)度(du)凍存(cun)，最(zui)終(zhong)保存(cun)於(yu)液氮中。在極低(di)的溫(wen)度下(xia)，細(xi)胞保存(cun)的時間幾乎是無(wu)限(xian)的。復(fu)蘇壹般(ban)采用(yong)快融(rong)方(fang)法(fa)，即從(cong)液氮中取出凍存(cun)管(guan)後(hou)，立即(ji)放入(ru)37℃水(shui)中，使之(zhi)在(zai)壹分鐘內(nei)迅(xun)速(su)融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞轉(zhuan)入(ru)培(pei)養(yang)器皿(min)中進行培(pei)養(yang)。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞分(fen)離

凡(fan)是來源於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織器官及外周(zhou)血，經特(te)殊(shu)分離方(fang)法(fa)制(zhi)備而(er)來(lai)的原(yuan)初(chu)培(pei)養(yang)的細(xi)胞稱之(zhi)為原(yuan)代(dai)細(xi)胞。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞的分離方(fang)法(fa)組織材(cai)料(liao)若(ruo)來自血液、羊(yang)水(shui)、胸水(shui)或腹(fu)水(shui)的懸液材料(liao)，的方(fang)法(fa)是采用(yong)1000r/min的低速(su)離心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離心(xin)後(hou)由於(yu)各(ge)種(zhong)細(xi)胞的比重不(bu)同(tong)可(ke)在分層液中形成不同(tong)層(ceng)，這(zhe)樣(yang)可根(gen)據需(xu)要收獲目的細(xi)胞。2實(shi)體(ti)組織材(cai)料(liao)的分離方(fang)法(fa)對於(yu)實(shi)體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)，由於(yu)細(xi)胞間結(jie)合(he)緊密(mi)，為了(le)使組(zu)織中的細(xi)胞充(chong)分(fen)分散(san)，形成細(xi)胞懸(xuan)液，可采用(yong)機械分(fen)散法(fa)（物理(li)裂(lie)解(jie)）和消(xiao)化分離法(fa)。

三(san)、細(xi)胞增殖(zhi)檢(jian)測技術(shu)

目(mu)前主要有兩種用(yong)於(yu)檢(jian)測細(xi)胞增殖(zhi)能(neng)力(li)的方(fang)法(fa)。壹種是直接(jie)的方(fang)法(fa)，通過(guo)直接(jie)測定(ding)進(jin)行(xing)分(fen)裂

的細(xi)胞數來評(ping)價細(xi)胞的增殖(zhi)能(neng)力(li)。另壹種是間接(jie)的方(fang)法(fa)，即細(xi)胞活(huo)力(li)（cell viability）檢測方(fang)法(fa)，通過(guo)檢測樣(yang)品(pin)中健(jian)康(kang)細(xi)胞的數目來評(ping)價細(xi)胞的增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯然，細(xi)胞活(huo)力(li)檢測法(fa)並不(bu)能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明(ming)檢(jian)測樣(yang)品(pin)中的細(xi)胞是(shi)否在增殖(zhi)。如(ru)細(xi)胞在(zai)某(mou)壹培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)下(xia)會自(zi)發啟動雕(diao)亡(wang)程序，但(dan)藥物(wu)的幹擾可抑制(zhi)雕(diao)亡(wang)的發生(sheng)；這(zhe)時若(ruo)采用(yong)細(xi)胞活(huo)力(li)檢測法(fa)，顯然可(ke)以(yi)區(qu)分兩(liang)種條件下(xia)的細(xi)胞數量(liang)，但(dan)我們並不(bu)能(neng)從(cong)藥物(wu)幹(gan)擾組細(xi)胞數大於(yu)對照(zhao)組(zu)的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥物(wu)可(ke)促進細(xi)胞增殖(zhi)的結論(lun)。所(suo)以(yi)最(zui)直(zhi)接(jie)的證據(ju)應該采用(yong)方(fang)法(fa)壹。

取材：首(shou)先，用培(pei)養(yang)液濕(shi)潤所(suo)取的組織材(cai)料(liao)，並(bing)用鋒利(li)的眼科(ke)剪(jian)去除附在其上的脂肪(fang)和結(jie)締組織。接(jie)著用平(ping)衡(heng)液（如PBS或(huo)Hanks液）漂洗，再用眼科(ke)彎(wan)剪將(jiang)組織塊(kuai)剪(jian)成小塊。多次用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂洗，直(zhi)到液體清(qing)亮(liang)、無油滴(di)為止。

接(jie)種：用濕(shi)潤的吸管(guan)吸(xi)取切碎(sui)的組織塊(kuai)，輕(qing)輕吹(chui)到培(pei)養(yang)瓶(ping)皿(min)中，並按壹定(ding)間距(ju)均勻(yun)放(fang)在培(pei)養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上。註意不要過(guo)多，確(que)保組織塊(kuai)切面貼(tie)在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)翻轉(zhuan)，使瓶(ping)底朝(chao)上，在種(zhong)植了(le)組(zu)織塊(kuai)壹側的對側面加足培(pei)養(yang)液，避(bi)免(mian)組織塊(kuai)與培(pei)養(yang)液接(jie)觸，然後(hou)塞緊瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種植了(le)組(zu)織塊(kuai)的壹側朝上，靜置於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中。待組織塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到3小時後(hou)翻瓶(ping)，使貼(tie)壁(bi)的組織塊(kuai)浸沒在(zai)培(pei)養(yang)液中，繼(ji)續(xu)靜置。換液：每隔(ge)2到3天(tian)更(geng)換壹次培(pei)養(yang)液，或者(zhe)根(gen)據培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏色(se)的變化確(que)定(ding)換液時間。

壹、原(yuan)代(dai)細(xi)胞計數

將(jiang)血球(qiu)計數板(ban)及(ji)蓋片(pian)用(yong)擦試幹(gan)凈(jing)，並將(jiang)蓋片(pian)蓋在(zai)計數板(ban)上。

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液吸出(chu)少許，滴(di)加在蓋片(pian)邊緣，使懸(xuan)液充滿(man)蓋片(pian)和(he)計數板(ban)之(zhi)間。

靜置3分(fen)鐘。

鏡(jing)下(xia)觀察(cha)，計算(suan)計數板(ban)四(si)大格細(xi)胞總(zong)數，壓(ya)線(xian)細(xi)胞只(zhi)計左側和上方(fang)的。然後(hou)按下(xia)式(shi)計算(suan)：

細(xi)胞數/ml＝4大格細(xi)胞總(zong)數/ 4×10000

註意：鏡(jing)下(xia)偶(ou)見(jian)由兩個(ge)以(yi)上細(xi)胞組(zu)成(cheng)的細(xi)胞團(tuan)，應按(an)單(dan)個細(xi)胞計算(suan)，若(ruo)細(xi)胞團(tuan)占10%以(yi)上，說(shuo)明(ming)分(fen)散(san)不好(hao)，需重新(xin)制(zhi)備細(xi)胞懸(xuan)液。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液以(yi)0.5ml加入試(shi)管(guan)中。

加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2壹3分鐘。

吸(xi)取少許懸液塗於(yu)載(zai)玻片(pian)上，加上蓋片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取幾個任(ren)意視野(ye)分(fen)別計死(si)細(xi)胞和(he)活(huo)細(xi)胞數，計細(xi)胞活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞能(neng)被(bei)臺盼蘭染上色，鏡(jing)下(xia)可(ke)見(jian)深(shen)蘭色的細(xi)胞，活(huo)細(xi)胞不(bu)被(bei)染色，鏡(jing)下(xia)呈(cheng)無(wu)色(se)透(tou)明(ming)狀(zhuang)。

活力(li)測定(ding)可(ke)以(yi)和(he)細(xi)胞計數合(he)起來(lai)進行，但(dan)要考慮(lv)到染液對原(yuan)細(xi)胞懸(xuan)液的加倍(bei)稀釋作用。