【概(gai)要描(miao)述】雞卵泡顆粒細(xi)胞(bao)的(de)相關(guan)產品(pin)：人乳(ru)腺癌組(zu)織(zhi)源細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)椎間盤髓(sui)核細(xi)胞(bao)大(da)鼠視(shi)乳(ru)頭(tou)星形(xing)膠質細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)胸腺(xian)上(shang)皮細(xi)胞(bao)大(da)鼠脂(zhi)肪(fang)幹(gan)細(xi)胞(bao)人膠(jiao)質瘤(liu)組(zu)織(zhi)源細(xi)胞(bao)人宮(gong)頸(jing)癌組(zu)織(zhi)源細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)嗅上皮(pi)細(xi)胞(bao)大(da)鼠前(qian)列(lie)腺(xian)平滑肌(ji)細(xi)胞(bao)人皮(pi)膚癌組(zu)織(zhi)源細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)外周血(xue)中性(xing)粒細(xi)胞(bao)人子(zi)宮肌(ji)瘤(liu)組(zu)織(zhi)源細(xi)胞(bao)

雞卵泡顆粒細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基(ji)含(han)FBS、生長添(tian)加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻(pin)率(lv)每(mei)2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹次(ci)

生長特(te)性(xing)貼壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳代(dai)特(te)性(xing)可傳1代(dai)

消(xiao)化(hua)液0.25%

雞卵泡顆粒分離(li)自雞卵泡組織(zhi)；成(cheng)熟(shu)卵泡是卵巢(chao)的(de)組織(zhi)結(jie)構成(cheng)分之(zhi)壹，卵泡腔很(hen)大(da)，卵丘(qiu)很(hen)明(ming)顯。卵泡內膜細(xi)胞(bao)緊(jin)靠(kao)卵泡顆粒層(ceng)，與(yu)顆粒層(ceng)細(xi)胞(bao)之(zhi)間有壹(yi)層(ceng)基(ji)膜相隔(ge)，內膜細(xi)胞(bao)呈(cheng)多(duo)邊(bian)形(xing)，胞質清亮(liang)，胞(bao)核圓形(xing)，細(xi)胞(bao)間可見(jian)許多(duo)毛(mao)細(xi)血(xue)管(guan)，外(wai)膜細(xi)胞(bao)位(wei)於(yu)最(zui)外(wai)層(ceng)，多(duo)呈(cheng)梭(suo)形(xing)，與周圍結(jie)締組織(zhi)分(fen)界不明顯。卵泡(follicle)中卵母(mu)細(xi)胞(bao)四(si)周有(you)壹(yi)層(ceng)菱(ling)形(xing)或(huo)扁(bian)平細(xi)胞(bao)圍繞，在卵泡開始發(fa)育、卵細(xi)胞(bao)成(cheng)長(chang)的(de)同時(shi)，周圍的(de)菱(ling)形(xing)細(xi)胞(bao)變為(wei)立(li)方(fang)形(xing)，並由(you)單(dan)層(ceng)增生成復層(ceng)，因(yin)其細(xi)胞(bao)漿(jiang)內含(han)有顆粒，故稱為(wei)顆粒細(xi)胞(bao)。初(chu)級卵泡的(de)顆粒細(xi)胞(bao)為(wei)單(dan)層(ceng)；次(ci)級卵泡的(de)顆粒細(xi)胞(bao)增至(zhi)復層(ceng)；成(cheng)熟(shu)卵泡的(de)顆粒細(xi)胞(bao)展(zhan)開又變為(wei)單(dan)層(ceng)。顆粒細(xi)胞(bao)的(de)胞核大(da)而圓(yuan)，著(zhe)色(se)深(shen)，細(xi)胞(bao)的(de)遊離(li)面有(you)許多(duo)細(xi)長(chang)突起(qi)伸(shen)入(ru)放(fang)射(she)帶的(de)凹(ao)陷部。

方法(fa)簡(jian)介(jie)：

實(shi)驗室分離(li)的(de)雞卵泡顆粒采(cai)用先機(ji)械(xie)分離(li)後膠原酶(mei) - 聯(lian)合(he)消化(hua)法(fa)、並通(tong)過專(zhuan)用(yong)培(pei)養(yang)基(ji)培(pei)養(yang)篩(shai)選(xuan)制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)，細(xi)胞(bao)總(zong)量約(yue)為(wei)5×10⁵cells/瓶(ping)。

質量檢(jian)測(ce)：

實(shi)驗室分離(li)的(de)雞卵泡顆粒經FSHR免疫熒(ying)光鑒定(ding)，純(chun)度(du)可達90%以(yi)上(shang)，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體、細(xi)菌、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材 在無(wu)菌環(huan)境(jing)下(xia)從機(ji)體(ti)取(qu)出某(mou)種組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗目(mu)的(de)而定(ding)），經(jing)過壹定(ding)的(de)處理(li)（如消化(hua)分散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等）後接入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)血(xue)中，這(zhe)壹(yi)過程(cheng)稱為(wei)取(qu)材。如是細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養(yang)則(ze)無(wu)取(qu)材這(zhe)壹(yi)過程(cheng)。機(ji)體(ti)取(qu)出的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)稱為(wei)原代(dai)培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取(qu)得的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)接入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或(huo)培(pei)養(yang)板(ban)中(zhong)的(de)過程(cheng)稱為(wei)培(pei)養(yang)。3凍(dong)存及(ji)復蘇（可參閱(yue)後面有關章(zhang)節(jie)）為(wei)了保(bao)存細(xi)胞(bao)，特(te)別是(shi)不(bu)易(yi)獲得(de)的(de)突變型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍(dong)存。凍存的(de)溫度(du)壹(yi)般(ban)用液(ye)氮(dan)的(de)溫度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集至(zhi)凍(dong)存管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)含(han)保(bao)護(hu)劑（壹(yi)般(ban)為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘(gan)油(you)）的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，以(yi)壹(yi)定(ding)的(de)冷(leng)卻(que)速(su)度(du)凍存，最(zui)終保(bao)存於(yu)液氮(dan)中(zhong)。在極低的(de)溫度(du)下(xia)，細(xi)胞(bao)保(bao)存的(de)時間幾乎是無(wu)限的(de)。復蘇壹(yi)般(ban)采(cai)用快(kuai)融方(fang)法(fa)，即從液氮(dan)中(zhong)取(qu)出凍存管(guan)後，立(li)即放(fang)入(ru)37℃水(shui)中(zhong)，使之在壹(yi)分(fen)鐘內迅(xun)速(su)融解(jie)。然(ran)後將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)皿(min)中進行(xing)培(pei)養(yang)。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源於(yu)胚胎(tai)、組(zu)織(zhi)器(qi)官及(ji)外周血(xue)，經特(te)殊(shu)分離(li)方法(fa)制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)的(de)原初(chu)培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞(bao)稱之為(wei)原代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分離(li)方法(fa)組織(zhi)材(cai)料(liao)若來自血(xue)液、羊水(shui)、胸水(shui)或(huo)腹(fu)水(shui)的(de)懸(xuan)液(ye)材(cai)料(liao)，的(de)方法(fa)是采(cai)用1000r/min的(de)低速(su)離(li)心(xin)10分(fen)鐘。經離(li)心(xin)後由於(yu)各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比重不同(tong)可在分(fen)層(ceng)液(ye)中形(xing)成不(bu)同層(ceng)，這(zhe)樣(yang)可根據需要收(shou)獲(huo)目(mu)的(de)細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)的(de)分離(li)方法(fa)對於(yu)實體(ti)組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間結(jie)合(he)緊(jin)密(mi)，為(wei)了使組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用機(ji)械(xie)分散法(fa)（物理(li)裂解）和(he)消(xiao)化(hua)分離(li)法(fa)。

三(san)、細(xi)胞(bao)增殖檢(jian)測(ce)技術

目(mu)前(qian)主要有(you)兩(liang)種用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)增殖能力的(de)方法(fa)。壹種(zhong)是(shi)直(zhi)接的(de)方法(fa)，通(tong)過直(zhi)接測(ce)定(ding)進行(xing)分裂

的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增殖能力。另(ling)壹(yi)種(zhong)是間接的(de)方法(fa)，即細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，通(tong)過檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)健(jian)康細(xi)胞(bao)的(de)數目(mu)來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增殖能力。顯然(ran)，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測(ce)法(fa)並不(bu)能(neng)最(zui)終證(zheng)明檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)是(shi)否在增殖。如細(xi)胞(bao)在某(mou)壹培(pei)養(yang)條件(jian)下(xia)會自發啟(qi)動(dong)雕(diao)亡(wang)程(cheng)序，但(dan)藥(yao)物(wu)的(de)幹(gan)擾可抑制(zhi)雕(diao)亡(wang)的(de)發生；這(zhe)時(shi)若采(cai)用細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測(ce)法(fa)，顯然(ran)可以(yi)區(qu)分兩種(zhong)條件(jian)下(xia)的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)量，但(dan)我們並(bing)不能(neng)從(cong)藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組(zu)細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於(yu)對照(zhao)組的(de)事實(shi)說(shuo)明(ming)藥(yao)物(wu)可促進細(xi)胞(bao)增殖的(de)結(jie)論(lun)。所(suo)以(yi)最(zui)直(zhi)接的(de)證(zheng)據應該(gai)采(cai)用方法(fa)壹。

取(qu)材：首(shou)先，用(yong)培(pei)養(yang)液(ye)濕(shi)潤(run)所取(qu)的(de)組織(zhi)材(cai)料(liao)，並(bing)用鋒利的(de)眼科(ke)剪(jian)去除(chu)附(fu)在其(qi)上(shang)的(de)脂肪(fang)和(he)結(jie)締組織(zhi)。接著(zhe)用(yong)平衡液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗(xi)，再(zai)用(yong)眼科(ke)彎(wan)剪(jian)將(jiang)組織(zhi)塊剪(jian)成小(xiao)塊。多次(ci)用PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗(xi)，直(zhi)到液體(ti)清亮(liang)、無(wu)油滴為(wei)止(zhi)。

接種(zhong)：用濕(shi)潤(run)的(de)吸管(guan)吸(xi)取(qu)切(qie)碎的(de)組織(zhi)塊，輕(qing)輕(qing)吹到培(pei)養(yang)瓶(ping)皿(min)中，並按壹定(ding)間距均(jun)勻(yun)放(fang)在培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。註(zhu)意(yi)不要過多，確(que)保(bao)組(zu)織(zhi)塊切(qie)面貼在培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)翻轉，使(shi)瓶(ping)底(di)朝上(shang)，在種(zhong)植了組織(zhi)塊壹側(ce)的(de)對側(ce)面加(jia)足(zu)培(pei)養(yang)液(ye)，避(bi)免組織(zhi)塊與培(pei)養(yang)液(ye)接觸(chu)，然後塞緊(jin)瓶(ping)塞。將(jiang)種植了組織(zhi)塊的(de)壹側(ce)朝上，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組(zu)織(zhi)塊貼壁1到3小時(shi)後翻瓶，使(shi)貼(tie)壁的(de)組織(zhi)塊浸沒(mei)在培(pei)養(yang)液(ye)中(zhong)，繼續靜(jing)置(zhi)。換液：每(mei)隔(ge)2到3天更(geng)換壹次(ci)培(pei)養(yang)液(ye)，或(huo)者根據培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色的(de)變化(hua)確(que)定(ding)換(huan)液(ye)時間。

壹、原代(dai)細(xi)胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血(xue)球計數(shu)板及(ji)蓋(gai)片用(yong)擦(ca)試幹(gan)凈，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片蓋(gai)在計數(shu)板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出少(shao)許，滴加(jia)在蓋(gai)片邊(bian)緣，使懸(xuan)液(ye)充(chong)滿蓋(gai)片和(he)計數(shu)板之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分鐘。

鏡下(xia)觀察(cha)，計算計數(shu)板四(si)大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，壓線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左側(ce)和(he)上(shang)方(fang)的(de)。然後按下(xia)式(shi)計算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下(xia)偶見(jian)由(you)兩(liang)個以(yi)上(shang)細(xi)胞(bao)組(zu)成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團(tuan)，應按單(dan)個細(xi)胞(bao)計算，若細(xi)胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以(yi)上(shang)，說明分散不好(hao)，需重新制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管(guan)中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭(lan)染液，染色2壹3分(fen)鐘。

吸取(qu)少(shao)許懸(xuan)液(ye)塗(tu)於(yu)載(zai)玻片上(shang)，加(jia)上蓋(gai)片。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾個任(ren)意(yi)視野分別計死(si)細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺(tai)盼蘭(lan)染上色，鏡(jing)下(xia)可見(jian)深(shen)蘭(lan)色(se)的(de)細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染色，鏡下(xia)呈(cheng)無(wu)色透明狀(zhuang)。

活(huo)力測(ce)定(ding)可以(yi)和(he)細(xi)胞(bao)計數(shu)合(he)起(qi)來(lai)進行(xing)，但要考(kao)慮(lv)到染液對原細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的(de)加(jia)倍稀釋(shi)作(zuo)用(yong)。